细胞因子在结核早期诊断中的动力学评价

宋青山，贾芳，黄海荣

（1.内蒙古河套学院，内蒙古 巴彦淖尔 015000；2.首都医科大学附属北京胸科医院，北京 101149）

0 引言

结核病仍是当今全球面临的主要公共卫生问题之一，全世界每年都有新增成为活动性的结核。目前，大约有三分之一的人口感染了结核分枝杆菌，其中有大部分为潜伏性结核感染，还有部分在没有细菌学检测的情况下直接按照结核病治疗[1]。结核病患者大多数来自发展中国家，且结核病又是慢性病，治疗结核病的时间较长和金钱花销较多。若能有简单、快速敏感性高的检测结核病的方法将会给人类带来极大的好处。结核病预后取决于抗结核治疗的早晚，不同时期的结核病人其疗效、预后截然不同，故结核病的早期、快速、准确诊断对于早期化疗和控制传播都至关重要。

1 材料与方法

1.1 病例的纳入

2016 年10 月至2017 年8 月来自昌平医院结防所初治结核病人43 例。所有纳入病例都签署书面知情同意书，所有痰涂片阳性和痰涂片阴性的患者都被诊断为患有结核病。由医院工作人员连续登记。回顾性地将患者分为三组，一组为涂片阳性，培养阳性的病例（记为S+C+）；二组为涂片阴性，培养阳性的病例（记为S-C+），三组为涂片阴性，培养阴性的病例（记为S-C-）。

1.2 血清收集

在开始抗结核治疗前(第0 天)和治疗一周之后（7 天后）采集血样。血液样品(2-5 mL)在无抗凝剂的空泡管中采集后，在室温下静置30-60 min，然后将样品在1500 rpm 下离心15 min 后吸取上清分装冻存在-80 ℃。

1.3 细胞因子动态变化测定方法

选择已报道的与结核病免疫应答密切相关的细胞 因 子IP-10、IL-10、IL-27、MCP-1、sIL-2 R、INF-γ、TNF-α、IL-12、IL-4、IL-6 ELISA 试 剂盒（购自BlueGene），严格按照产品说明书进行操作。选择酶标仪在450 nm 波长下读取（OD）结果。每孔设置三个重复孔，求平均OD 值。数据分析用ELISACalc 软件以OD 值为Y 轴，以细胞因子浓度为X 轴做4 参数回归标准曲线，然后计算出样品OD 值所对应的细胞因子浓度。

1.4 统计分析

用统计分析软件SPSS 20.0 进行数理统计分析，多组完全随机计量资料用Mann-Whitney U、Kruskal-Wilcoxon 秩和检验，样本间两两用Nemenyi 秩和检验。并绘制ROC 曲线以评价试验的敏感性和特异性。

2 结果

2.1 病人纳入情况

病人在确诊为结核病时，在服药之前要进行肝功能的检测，这时我们采集到的是病人治疗前(第0天)的血清，治疗一周之后（7 天后）再检测肝功能，这时我们采集到的是病人治疗7 天后的血清。病人首先要满足医院检查的血量需要，因此血量有限，难以满足所检查的细胞因子用相同病人的血样，又由于是回顾性的研究，例数也不尽一样（详细所选例数见表1）。

表1 各种细胞因子病人纳入的人数

2.2 Logistic 标准曲线拟合

以OD 值为Y 轴，以细胞因子浓度为X 轴做4 参数回归标准曲线，以IFN-α 为例（见图1）。曲线方程：y=(A-D)/[1+(x/C)B]+D。

A=1.62840，B=1.08438，C=272.59575，D=0.00256，r2=0.99849

图1 lFN-α 标准曲线

2.3 细胞因子动态变化情况

2.3.1 S+C+、S-C+、S-C-三组细胞因子血清含量均值变化

用Mann-WhitneyU 检验比较S+C+、S-C+、S-C-各组治 疗 前 后IP-10、IL-10、IL-27、MCP-1、sIL-2 R、INF-γ、TNF-α、IL-12、IL-4、IL-6 血清含量均值发现，这些细胞因子治疗前和治疗后无统计学 意 义（U=49，P=0.94）。Kruskal-Wilcoxon检验比较S+C+、S-C+、S-C-三组治疗前之间无统计学意义（χ2=0.56，P=0.76）及三组治疗后之间无统计学意义（χ2=0.24，P=0.89），从图2 中可以看出S+C+、S-C+、S-C-三组治疗前后细胞因子含量比较，在S+C+组中，治疗前到治疗后IP-10、IL-27、TNF-α、IL-4 是升高了，而其它的细胞因子降低了。在S-C+组中，只有IP-10 和IL-4 是升高了，而其它的细胞因子降低了。在S-C-组中，TNF-α 和sIL-2R是升高了，而其它的细胞因子降低了。

2.3.2 S+C+、S-C+、S-C-三组各细胞因子动态变化

三组各细胞因子变化数目见表2，IP-10 在治疗前S+C+、S-C+、S-C-三组血清含量差异无统计学意义（P=0.28），治疗7 天后IP-10 血清含量变化如图3A，在S+C+中，有2 个是增加，有2 个是减少；在S-C+中有4 个增加，8 个减少；在S-C-中，有17个增加，11 个减少。

IL-27 在 治 疗 前S+C+、S-C+、S-C-三组血清含量差异无统计学意义（P=0.196），治疗7 天后IL-27 血清含量变化如图3B，在S+C+中，有4 个是增加，有2 个是减少；在S-C+中有7 个增加，3 个减少；在S-C-中，有13 个增加，14 个减少。

MCP-10 在治疗前S+C+、S-C+、S-C-三组血清含量差异无统计学意义（P=0.559），治疗7 天后MCP-10 血清含量变化如图3C，在S+C+中，有2 个是增加，有3 个是减少；在S-C+中有5 个增加，7个减少；在S-C-中，有5 个增加，21 个减少。

IL-10 在治疗前S+C+、S-C+、S-C-三组血清含量差异无统计学意义（P=0.67），治疗7 天后IL-10 血清含量变化如图3D，在S+C+中，有2 个是增加，有3 个是减少；在S-C+中有3 个增加，5个减少；在S-C-中，有8 个增加，9 个减少。

TNF-α 在治疗前S+C+、S-C+、S-C-三组血清含量差异无统计学意义（P=0.054），治疗7 天后IP-10 血清含量变化如图3E，在S+C+中，有2 个是增加，有1 个是减少；在S-C+中有5 个增加，4 个减少；在S-C-中，有6 个增加，8 个减少。

sIL-2R 在 治 疗 前S+C+、S-C+、S-C-三 组 血 清含量差异无统计学意义（P=0.36），治疗7 天后sIL-2R 血清含量变化如图3F，在S+C+中，有1 个是增加，有3 个是减少；在S-C+中有3 个增加，8个减少；在S-C-中，有8 个增加，13 个减少。

IL-12 在治疗前S+C+、S-C+、S-C-三组血清含量差异无统计学意义（P=0.57），治疗7 天后IL-12 血清含量变化如图3G，在S+C+中，有1 个是增加，有2 个是减少；在S-C+中有3 个增加，3个减少；在S-C-中，有10 个增加，0 个减少。

INF-γ 在治疗前S+C+、S-C+、S-C-三组血清含量差异无统计学意义（P=0.13），治疗7 天后INF-γ 血清含量变化如图3H，在S+C+中，有3 个是增加，有0 个是减少；在S-C+中有4 个增加，2个减少；在S-C-中，有2 个增加，8 个减少。

IL-6 在治疗前S+C+、S-C+、S-C-三组血清含量差异无统计学意义（P=0.89），治疗7 天后IL-6 血清含量变化如图3I，在S+C+中，有1 个是增加，有2个是减少；在S-C+中有2 个增加，4 个减少；在S-C-中，有1 个增加，9 个减少。

IL-4 在治疗前S+C+、S-C+、S-C-三组血清含量差异无统计学意义（P=0.156），治疗7 天后IL-4 血清含量变化如图3 J，在S+C+中，有1 个是增加，有0 个是减少；在S-C+中有1 个增加，1 个减少；在S-C-中，有1 个增加，5 个减少。

表2 1 S+C+、S-C+、S-C-三组各细胞因子动态变化数目

图2 S+C+、S-C+、S-C-三组治疗前后细胞因子含量比较

图3 （A-J）S+C+、S-C+、S-C-各细胞因子动态变化曲线

2.4 ROC 曲线检验细胞因子与S+C+、S-C+、S-C-的相关性

得到ROC 曲线，证明细胞因子在治疗的第0 天至第7 天之间的变化，以确定细胞因子作为结核病诊断的评价因子。对于IP-10,在S+C+、S-C+、S-C-之间 ROC 曲线下面积为0.33 [95 % CI 0.14-0.58]，P＞0.05。对于IP-10 治疗前后的变化，ROC 曲线下面积为0.54[95 % CI 0.13-0.95]，P＞0.05。

3 讨论

尽管新技术的发展，痰涂片阴性结核病患者的诊断仍然是一个临床挑战，近几十年的体外检测结核病试验使得将近一半的病人接受了临床怀疑，中低水平收入的结核病患者在没有细菌学证实下接受了结核病治疗[2]。因此，这些患者中有许多人可能没有患结核病，而且长时间暴露在不必要的环境中使用抗结核药物进行治疗。因此，迫切需要开发新的确诊结核病诊断工具应用于临床诊断。

我们试图想去发现一个细胞因子能够表现出来特别的诊断优势，于是对IP-10、IL-10、IL-27、MCP-1、sIL-2R、INF-γ、TNF-α、IL-12、IL-4、IL-6 10 个细胞因子做出评价，但是令人遗憾的是结果并不像我们想象的那样，经过统计学分析发现10个细胞因子在S+C+、S-C+、S-C-三组并没有统计学意义，也就是说这10 个细胞因子在结核菌培养阳性、涂片阳性、培养阴性、涂片阴性之间没有明确的区别。10 个细胞因子中，每个细胞因子血清含量均值在治疗前和治疗后无统计学意义。说明这10 个细胞因子在治疗前(第0 天)和治疗一周之后（7 天）没有统计的变化规律。这次评价与大多数患者的IP-10基线都有所增加浓度[3]，IP-10 血清水平以前被发现在病人中升高结核病[4-6]结果存在不相一致性。

但是值得我们注意的是我们看到了每个人每个细胞因子在治疗前后是有变化的（表2 和图3）。尽管这些变化有增有减没有规律可循。这些就会提醒我们今后去寻找他们变化的原因。是其它的疾病影响到了这些细胞因子的变化[7,8]，还是临床治疗方案影响到了他们的变化，还是患者本身感染的结核分枝杆菌存在差异，如有的是敏感的结核分枝杆菌，有的则是MDR 或XDR。我们也试图想发现患者在治疗过程中耐药性的转化于细胞因子的相关性，在随后的随访中发现，我们研究的患者经过抗结核病的治疗都出现好转，只有1 例效果不明显转为耐药菌株，由于病例太少只发现IP-10、IL-27、sIL-2 R 的变化，没有找到变化规律。