枳椇水提液改善慢性酒精性肝损伤作用研究

楚胜，李传俊

（漯河医学高等专科学校，河南 漯河 462000）

0 引言

枳椇(Hovenia) 属鼠李科(Rhamnaceae) 枳椇属(Hovenia)植物干燥成熟的种子，学名枳椇子，枳椇在1500 多年前我国已作为药用，载于《唐本草》，药用部分为带有肉质果柄的果实或种子。至近现代,药用部位从枝木及花序轴发展到果实和种子,而功效基本一致[1]。《本草纲目》中记述：枳椇功用同蜂蜜；可解酒毒，辟虫毒。

当今社会，社交场合，存在普遍饮酒现象。长期饮酒导致体内放生酒精慢性蓄积，作为酒精代谢的主要场所，发生酒精性肝损伤的势头很猛[2]。为了减轻长期饮酒者酒精对肝损伤影响，本文通过建立小鼠慢性酒精性肝损伤模型，观察给予枳椇水提物灌胃慢性酒精性肝损伤模型小鼠生化指标的变化以及肝组织脂肪变性程度，研究枳椇水提物对慢性酒精性肝损伤模型小鼠的作用，为因饮酒导致的肝损伤者寻找具有保肝护肝功效的药食物提供一些建议。

1 实验材料与仪器

1.1 试剂

超氧化物歧化酶(SOD)测试试剂盒、丙二醛(MDA)测试试剂盒、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)测试试剂盒、血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)测试试剂盒，中生北控生物科技股份有限公司；56 度白酒，北京红星股份有限公司；生理盐水，华润双鹤药业股份有限公司；枳椇水提液：低剂量（1 mg/mL）、中剂量（2 mg/mL）、高剂量（4 mg/mL）；苏丹Ⅲ染色剂。

1.2 动物

购买昆明种雄性小鼠，饲养于漯河医专动物房，饲养期间控制温湿度，温度20～26 ℃，相对湿度为35%～70 %。

1.3 仪器

旋转蒸发仪R-1005，郑州紫拓仪器设备有限公司；BLOBASE-EL10A 多功能酶标仪，济南高奎医疗器械有限公司；Happy-TL16 台式离心机，济南福的机械有限公司；超净工作台，东莞雅宁公司；显微镜YRS-32，上海远仞检测设备有限公司；KD-2850 冷冻切片机，北京世纪科信科学仪器公司。

2 方法

2.1 实验方法

2.1.1 枳椇水提液

枳椇碾成粗粉，用水浸提24 h,浸提液保存待用；滤渣加水煎煮两次,过滤合并两次滤液；提合并浸提液、煎煮液后，置于旋转蒸发仪内，浓缩为浓缩液，置于冰箱内备用。实验前取适量浓缩液加水稀释成含枳椇1 mg/mL、2 mg/mL、4 mg/mL 水提液，待用。

2.1.2 慢性酒精性肝损伤实验

选取昆明种雄性小鼠40 只，称重（25±2）g，随机分成五组，枳椇水提液低、中、高剂量组、模型组和正常组，每组8 只。实验用小鼠除正常对照组外，其他组小鼠按任彬彬等[3]造模方法，每日用56 度白酒灌胃，剂量10 mL/kg，连续3 周。慢性酒精性肝损伤模型建模成功，开始实验，枳椇水提物低剂量组、枳椇水提物中剂量组、枳椇水提物高剂量组分别用1 mg/mL、2 mg/mL、4 mg/mL 的枳椇水提液罐胃，1 次/d,0.5 mL/次，连用15 d；正常组和模型组用纯化水罐胃，1 次/d,0.5 mL/次，连用15 d。最后一次罐胃2 h 后开始进行生化指标检测。

2.2 实验指标及检测方法

2.2.1 实验指标

选取小鼠血清谷草转氨酶（AST）含量、谷丙转氨酶（ALT）含量、丙二醛（MDA）含量、超氧化物歧化酶（SOD）活性及肝组织脂肪变性评分作为本实验的指标。

2.2.2 实验指标检测

摘除小鼠眼球取血，静置，离心机3000/min，离心15 min 后取出血清，按试剂盒说明书要求操作，定量测定各组小鼠谷草转氨酶（AST）、谷丙转氨酶（ALT）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）活性，结果详见表1、表2。

2.2.3 肝组织病理学检查

取肝叶冷冻切片，苏丹Ⅲ染色剂，40×10 显微镜下观察脂滴分布、范围，进行肝组织病理学检查评分。

2.3 统计学处理

3 实验结果与分析

3.1 枳椇水提液对慢性酒精肝损伤小鼠血清ALT、AST 影响

表1 表明：不同剂量组与模型组组间比较，低剂量组ALT（P＜0.05）与模型组差异有统计学意义，ATS（P＞0.05）与模型组差异无统计学意义；中剂量组ALT（P＜0.01）与模型组差异有非常显著统计学意义，ATS（P＞0.05）与模型组差异无统计学意义；高剂量组ALT（P＜0.01）与模型组差异有非常显著统计学意义，ATS（P＜0.05）与模型组差异有显著统计学意义。

3.2 枳椇水提液对慢性酒精肝损伤小鼠血清MAD、SOD 影响

表2 表明：不同剂量组与模型组组间比较，低剂量组MAD、SOD 指标P 值均大于0.05，与模型组差异无统计学意义；中剂量组MAD（P＜0.01）与模型组差异有非常显著统计学意义，SOD（P＞0.05）与模型组差异无统计学意义；高剂量组中剂量组MDA（P＜0.01）与模型组差异有非常显著统计学意义，SOD（P＜0.05）与模型组差异有显著统计学意义。

3.3 小鼠肝脏组织病理学检查结果

苏丹Ⅲ染色，显微镜下染成观察橘红色的脂滴，按照评分标准（橘红色的脂滴散在、稀少为0分；含橘红色的脂滴≤1/4 为1 分；含橘红色的脂滴≤1/2 为2 分；含橘红色的脂滴≤3/4 为3 分；含橘红色的脂滴＞3/4 为4 分）。结果见表3。结果显示，模型组与正常组有非常显著统计学差异，说明动物建模成功；各剂量组与模型组比较，高剂量组有显著的统计学差异，表明高剂量组缓解慢性酒精性肝损伤小鼠肝组织脂肪的变性。

表3 枳椇水提液对慢性酒精肝损伤小鼠肝组织脂肪变性的影响（n=8,±s）

表3 枳椇水提液对慢性酒精肝损伤小鼠肝组织脂肪变性的影响（n=8,±s）

注：与正常对照组比较，*表示差异显著(P＜0.05)，**表示差异极显著(P＜0.01)；与模型组比较，#表示差异显著(P＜0.05)，##表示差异极显著(P＜0.01)。

4 讨论

4.1 动物建模及实验指标

模型组与对照组比较，生化指标ALT、ATS、MAD和SOD，以及肝组织病理学检查评分指标均有非常显著统计学意义差异（P＜0.01），说明慢性酒精性肝损伤小鼠建模成功，表明实验中采用的任彬彬、李国莉、刘贺荣等[3]造模方法是有效的方法。

表1 枳椇水提液对慢性酒精肝损伤小鼠血清ALT、AST 影响（n=8,±s）

表1 枳椇水提液对慢性酒精肝损伤小鼠血清ALT、AST 影响（n=8,±s）

注：与正常对照组比较，*表示差异显著(P＜0.05)，**表示差异极显著(P＜0.01)；与模型组比较，#表示差异显著(P＜0.05)，##表示差异极显著(P＜0.01)。

表2 枳椇水提液对慢性酒精肝损伤小鼠血清MAD、SOD 影响（n=8,±s）

表2 枳椇水提液对慢性酒精肝损伤小鼠血清MAD、SOD 影响（n=8,±s）

注：与正常对照组比较，*表示差异显著(P＜0.05)，**表示差异极显著(P＜0.01)；与模型组比较，#表示差异显著(P＜0.05)，##表示差异极显著(P＜0.01)。

饮酒者饮久后，进入机体的酒精可以引起体内AST、ALT 含量升高[4-5]；酒精的代谢主要器官是肝，进入肝组织的酒精能引起肝细胞膜脂质过氧化，从而影响肝功，而MDA 又是肝细胞膜脂质过氧化的终末产物之一，故可以用肝组织中MDA 含量间接反映肝损伤的受损程度[6]；SOD 阻止肝损伤、修复损伤肝细胞，故SOD 活性可以反映肝受损速度及受损肝细胞修复能力[7]。综上，本实验选取血清ALT、AST 和MDA 含量及SOD 活性作为检测肝损伤的生化指标[8]。

4.2 枳椇水提液对酒精性急性肝损伤小鼠保护作用

肝脏是酒精的主要代谢场所，因为只有肝脏内才具有代谢酒精的特有酶类。酒精在机体代谢主要有3 条途径：

（1）胞质内酒精脱氢酶（ADH）途径

CH3CH2OH+氧化型辅酶Ⅰ→CH3CHO+还原型辅酶I+H+

（2）内质网微粒体酒精氧化(MEOS)途径

CH3CH2OH+氧化型辅酶Ⅱ+O2+H+→CH3CHO+还原型辅酶Ⅱ+2H2O

（3）过氧化小体上过氧化氢酶(CAT)途径

CH3CH2OH+过氧化氢→CH3CH2O+2H2O

三种路径酒精均被氧化成为乙醛，乙醛浓度过高损害肝脏并显著降低肝脏对氧的利用，并加剧自由基介导的不良反应和脂质过氧化作用。另外，酒精代谢产生还原型辅酶I、还原型辅酶Ⅱ影响糖代谢，产生氧自由基，引起肝细胞损伤[9-10]。模型组小鼠肝组织的MDA 升高非常显著，SOD 活性降低也非常显著。

枳椇水提液具有显著增强小鼠肝脏乙醇脱氢酶活性的作用[11]，加快机体内酒精代谢，降低酒精对肝脏的损伤。枳椇含有山奈酚、双氢山奈酚、洋芹素、杨梅黄素、榭皮素等多个黄酮类化合物[12-13]，其有抗氧化、清除自由基的作用。实验中枳椇水提液能够降低肝损伤小鼠肝脏内氧自由基，降低MDA 含量，提高SOD 活性，可能与枳椇含有的黄酮类成分有关。

小鼠肝脏组织病理学检查结果表明，高剂量组缓解慢性酒精性肝损伤小鼠肝组织脂肪的变性。枳椇子含有枳椇皂苷A1、A2、B1、B2等皂苷雷成分，枳椇皂昔能明抑制组胺释放[14]，故降低了肝脏的炎性反应，从而减轻或减缓肝脏的损伤。枳椇子水提取液能显著提高肝细胞存活时间和增殖率，对肝细胞具有促生长活性[15]，进而减缓肝脏脂肪变性，加快受损肝细胞的修复。

综上所述，枳椇水提液高剂量组对酒精性肝损伤具有保护作用，有利于酒精性肝损伤者肝细胞修复，值得在实践中应用。但枳椇对于受损肝脏的保护作用的物质基础不够清晰明确，建议继续探讨研究。