MicroRNA-4465对结肠癌细胞凋亡和侵袭的影响

杨继岚，李杨，邓明佳，胡凤娣，谢琳，龙庭凤

0 引言

结直肠癌（colorectal cancer, CRC）是常见的恶性肿瘤之一，严重危害人类健康。有关结肠癌发生、发展及转移的分子机制仍不十分清楚，发现及研究新的分子在肿瘤发生发展过程中的作用具有重要的意义。微小RNA（microRNA,miRNA）是一类负向调控基因表达的非编码单链RNA，通过与靶基因信使RNA（mRNA）的3'-非翻译区（3'-untranslated region, 3'-UTR）完全或不完全碱基配对，引发靶基因mRNA的降解和（或）翻译抑制，从而对生物体的生长、发育和分化起着广泛的调控作用，并与包括肿瘤在内的多种疾病的发生、发展密切相关[1-2]。近年来研究发现，miR-26家族在肿瘤调控过程中具有重要的作用，通常被认为是肿瘤抑制因子[3-4]。作为miR-26家族的一员，miR-4465影响非小细胞肺癌进程[5]，但其在CRC中的作用仍需进一步探讨。本研究主要探讨miR-4465对结肠癌细胞活性、凋亡以及侵袭的影响，初步探索其潜在的调控机制。

1 材料与方法

1.1 材料

NCM460、SW480、HT-29和HCT-116细胞均购自中国科学院上海生化和细胞生物研究所。DMEM培养液、胎牛血清、胰蛋白酶购自美国Gibco公司。MiR-4465 mimic及阴性对照mimic-NC购自上海吉玛制药技术有限公司。转染试剂Lipofectamine3000和RNA提取试剂TRIzol购自美国Invitrogen公司。反转录试剂盒和实时荧光定量PCR检测试剂盒均购自日本TaKaRa公司。MTT试剂盒、Annexin V-FITC/PI细胞凋亡试剂盒购自南京凯基生物有限公司。Caspase-3活性检测试剂盒、RIPA细胞裂解液、PMSF和BCA蛋白含量测定试剂盒购自上海碧云天生物技术研究所。HMGA1多克隆抗体、HMGA2多克隆抗体、EZH2多克隆抗体和β-actin多克隆抗体均购自美国Abcam公司。山羊抗兔、山羊抗小鼠等二抗购自北京中杉金桥生物技术有限公司。荧光素酶报告基因检测试剂盒购自广州锐博生物科技有限公司。

1.2 细胞培养和转染

将细胞置于含10%胎牛血清、100 u/ml青霉素和100 μg/ml链霉素的DMEM培养基中，在95%O2、5%CO2、37℃的培养箱中培养。细胞融合至80%～90%时，进行消化传代，将细胞接种于合适规格的孔板中，待细胞融合达到60%～70%时，按说明书进行操作Lipofectamine3000转染mimics和质粒。

1.3 qPCR分析miR-4465以及HMGA1、HMGA2和EZH2的mRNA表达水平

TRIzol法提取细胞总RNA，紫外分光光度计测定D260nm和D280nm值，测定总RNA的浓度和纯度。用反转录试剂盒将RNA反转录成cDNA，以cDNA为模板按实时荧光定量PCR检测试剂盒说明书进行PCR扩增。PCR反应条件为：预变性95℃10 min；变性94℃ 30 s；退火59℃ 20 s；延伸72℃30 s；40个循环。以U6的表达水平为内参，用2-ΔΔCt方法分析miR-4465以及HMGA1、HMGA2和EZH2的相对表达水平。

1.4 MTT法检测细胞活性

细胞转染48 h后，每孔加入10 μl MTT试剂（0.5 mg/μl），在37℃培养箱中孵育4 h。弃培养基，每孔加入150 μl二甲基亚砜溶液，轻轻振荡使蓝色结晶完全溶解，在酶标仪490 nm处检测吸光度（OD）值。细胞活性（%）=（OD实验组-OD空白组）/（OD对照组-OD空白组）×100% 。

1.5 流式细胞仪检测细胞凋亡水平

细胞转染48 h后，经消化、洗涤、离心后，弃去上清液，然后每管加100 μl 1×结合缓冲液吹打悬浮细胞，再加入5 μl Annexin V-FITC和5 μl PI染色，轻轻摇匀后，在室温下闭光孵育15 min。随后加入400 μl 1×结合缓冲液，于1 h内上机检测细胞凋亡水平。

1.6 Caspase-3活性检测

细胞转染48 h后，按Caspase-3活性检测试剂盒说明书进行操作，在酶标仪405 nm处检测OD值。OD值越大，Caspase-3活性越强。

1.7 Transwell检测细胞侵袭能力

细胞转染48 h后，经消化、洗涤、离心后，更换无血清培养基，调整细胞密度为5×105个/毫升。在预铺有Matrigel胶的Transwell小室中加入200 μl细胞悬液，下室中加入含10%FBS的DMEM培养基，共培养24 h后，取出上室，棉签擦去上室的残留细胞，90%酒精常温固定30 min，0.1%结晶紫常温染色10 min，显微镜拍照并计数。每组均设3个复孔，且每个复孔均随机选取5个视野进行统计。

1.8 荧光素酶报告基因检测

通过PCR扩增出含有miR-4465结合位点的HMGA1 3'-UTR、HMGA2 3'-UTR以及EZH2 3'-UTR序列，将扩增序列分别克隆到pGL3-basic载体中，命名为pGL3-HMGA1 3'-UTR载体、pGL3-HMGA2 3'-UTR载体或pGL3-EZH2 3'-UTR载体。通过基因定点诱变构建出pGL3-HMGA1 3'-UTR mut载体、pGL3-HMGA2 3'-UTR mut载体或pGL3-EZH2 3'-UTR mut载体，作为阴性对照。然后，将pGL3载体与mimic或mimic-NC，连同pRL-TK载体共转染到细胞中。转染48 h后，收集细胞，按照双荧光素酶报告基因检测试剂盒说明书检测荧光素酶活性。

1.9 Western blot分析HMGA1、HMGA2和EZH2的蛋白表达水平

用RIPA裂解液与PMSF的混合液（99:1）裂解细胞15 min，离心收集上清液，BCA蛋白试剂盒进行蛋白定量。取适量蛋白进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，采用半干转方法将蛋白质转移到硝酸纤维素膜上。用5%脱脂奶粉室温封闭1 h后，加入HMGA1（1:1 000）、HMGA2（1:1 000）和EZH2（1:1 000）一抗4℃孵育过夜，之后加入二抗室温孵育1 h。用Odyssey红外激光成像系统检测各条带的灰度值，以GAPDH为内参分析相对蛋白表达。

1.10 统计学方法

采用GraphPad Prism 5软件进行数据分析，所有数据以至少三次独立实验的平均值±标准差表示。多组之间的比较采用单因素方差分析，组内两两比较进行Bonferroni检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-4465过表达抑制结肠癌细胞活性

qPCR检测发现，与人的正常结肠上皮细胞系NCM460相比，miR-4465在SW480、HT-29和HCT-116三种结肠癌细胞系中的表达显著下调（P=0.0002），见图1A，提示miR-4465在结肠癌细胞中具有重要的作用。然后在HCT-116细胞中转染miR-4465 mimic，转染mimic-NC作为阴性对照，与对照组或mimic-NC组相比，miR-4465表达显著升高（P＜0.05），见图1B。MTT检测发现，与对照组或mimic-NC组相比，miR-4465过表达显著降低HCT-116的细胞活性（P=0.0076），见图1C。

图1 miR-4465过表达抑制结肠癌细胞活性Figure1 miR-4465 overexpression suppressed viability of colon cancer cells

2.2 miR-4465过表达促进结肠癌细胞凋亡

流式细胞仪检测发现，与对照组或mimic-NC组相比，miR-4465过表达显著提升HCT-116细胞的凋亡率（P＜0.0001），见图2A、B。同时，检测Caspase-3活性发现，miR-4465过表达显著提高其活性（P=0.0001），见图2C。

图2 miR-4465过表达促进结肠癌细胞凋亡Figure2 miR-4465 overexpression promoted apoptosis of colon cancer cells

2.3 miR-4465过表达抑制结肠癌细胞侵袭

Transwell检测发现，与对照组或mimic-NC组相比，miR-4465 mimic组的侵袭细胞数显著降低（P=0.0066），见图3。

2.4 miR-4465分别靶向HMGA1、HMGA2、EZH2的3'-UTR

通过软件预测，miR-4465与HMGA1、HMGA2以及EZH2的3'-UTR之间均存在靶向序列，见图4A。进一步通过荧光素酶报告基因检测发现，与mimic-NC组相比，miR-4465过表达显著降低pGL3-HMGA1 3'-UTR质粒（P=0.0003，见图4B）、pGL3-HMGA2 3'-UTR质粒（P=0.0017，图4C）以及pGL3-EZH2 3'-UTR质粒（P=0.002，图4D）的荧光素酶活性，而不影响对应的突变质粒的荧光素酶活性（P＞0.05）。

2.5 miR-4465过表达抑制HMGA1、HMGA2和EZH2的表达

Western blot检测发现，与对照组或mimic-NC组相比，miR-4465过表达显著下调HMGA1（P=0.0006，图5A）、HMGA2（P=0.0023，图5B）以及EZH2（P=0.0039，图5C）蛋白的表达。进一步通过qPCR检测发现，与对照组或mimic-NC组相比，miR-4465过表达显著下调HMGA1（P＜0.0001，图5D）、HMGA2（P=0.0003，图5E）以及EZH2（P=0.0021，图5F）mRNA的表达。

图3 miR-4465过表达抑制结肠癌细胞侵袭Figure3 miR-4465 overexpression suppressed invasion of colon cancer cells

图4 miR-4465分别靶向HMGA1、HMGA2和EZH2的3’-UTRFigure4 miR-4465 respectively targeted 3’-UTR of HMGA1, HMGA2 and EZH2

3 讨论

MiRNAs是一类进化上十分保守的RNA，通过转录后降解靶mRNA和（或）抑制基因翻译，调控多种靶基因的表达，且每一种miRNA都可以靶向多个靶基因。因此，miRNAs在调控基因表达和生命活动方面发挥着广泛的作用。异常表达的miRNA及其靶基因在肿瘤的发生发展中具有重要的调控功能，作为肿瘤的抑癌基因和（或）癌基因调控肿瘤的增殖、凋亡、迁移、侵袭等。越来越多的证据表明，miRNAs在CRC的发生发展中起重要作用，如miR-21-3p[6]、miR-184[7]、miR-630[8]和miR-150[9]。本研究通过过表达miR-4465，探讨其对结肠癌细胞活性、凋亡以及侵袭的影响，旨在为阐明结肠癌的病理机制提供一个新的依据。

图5 miR-4465过表达抑制HMGA1、HMGA2和EZH2的蛋白和mRNA表达Figure5 miR-4465 overexpression suppressed protein and mRNA expression of HMGA1, HMGA2 and EZH2

本研究发现，miR-4465在SW480、HT-29和HCT-116三种结肠癌细胞系中的表达均显著下调，提示miR-4465在结肠癌细胞中的重要作用。细胞增殖和凋亡不受控制是肿瘤发生的重要原因之一，其中Caspase-3是线粒体凋亡信号途径的一个关键蛋白。肿瘤细胞侵袭是肿瘤转移的一个重要部分。因此，启动肿瘤细胞的凋亡途径，抑制过度增殖和侵袭，是治疗肿瘤常用的重要手段。有研究表明，miRNAs在调控肿瘤细胞的凋亡和侵袭方面发挥重要的作用。张晓云等[10]研究发现，miR-143在CRC组织中表达量显著低于癌周正常组织。miR-143过表达可促进结肠癌细胞凋亡、抑制细胞迁移，且可能与其调控FOSL2基因表达相关。Wu等[11]研究发现，miR-21在CRC组织中的表达显著高于正常组织，其高表达与患者晚期肿瘤结节转移、淋巴结转移等密切相关。MiR-21过表达可通过靶向下调PTEN表达来抑制结肠癌细胞凋亡，促进细胞增殖和侵袭。Gao等[12]研究发现，miR-222过表达可通过靶向下调MIA3表达来促进结肠癌细胞的迁移和侵袭。本研究中发现miR-4465同样具有调控结肠癌细胞凋亡和侵袭的功能。MiR-4465过表达显著降低HCT-116的细胞活性，诱导细胞凋亡、提高Caspase-3活性，并且抑制细胞侵袭能力，提示miR-4465在CRC中发挥抑癌作用。

进一步探讨miR-4465的调控机制，通过预测miR-4465与HMGA1、HMGA2和EZH2之间均存在靶向互补序列，提示这三个基因可能是miR-4465的靶基因。有文献报道这三种基因在多种癌症，包括结肠癌中发挥促癌作用[13-15]，且受到miRNAs的调控。Fan等[16]研究发现，miR-543在CRC患者组织中表达下调，且体外过表达miR-543能够通过抑制HMGA2等基因来阻碍结肠癌细胞的增殖和侵袭。Sun等[5]研究发现，miR-4465能够通过直接靶向抑制EZH2的表达来阻碍非小细胞肺癌细胞的增殖和侵袭。本研究通过荧光素酶报告基因检测证实miR-4465能够分别靶向HMGA1、HMGA2和EZH2的3'-UTR来抑制它们的表达，提示miR-4465在CRC中的抗癌作用可能与抑制这三个致癌基因的表达有关。

综上所述，本研究表明miR-4465是结直肠癌的一个抑制因子，过表达能够降低结肠癌细胞的活性，促进细胞凋亡并降低细胞侵袭，这可能与靶向抑制HMGA1、HMGA2、EZH2的表达有关。本研究为进一步阐明结直肠癌的病理机制提供了新的依据，提示miR-4465可能是治疗结直肠癌的潜在靶点。