虫草花多糖提取工艺优化及其抗氧化特性

王振吉，杨申明*，许云香，周林宗

（楚雄师范学院 化学与生命科学学院，云南 楚雄 675000）

虫草花（Cordyceps militaris）隶属子囊菌亚门（Ascomycotina）麦角菌科（Clavicipitaceae）虫草属（Cordyceps），又称虫草子实体、不老草、蛹虫草等[1-2]。“虫草花”不是虫、不是草、也不是花，它是一种人工培养的虫草子实体，属虫、菌结合的真菌类[3]。虫草花中富含蛋白质、氨基酸以及虫草素、甘露醇、多糖等多种活性物质[4]，对于增强体内巨噬细胞功能、调节人体免疫力、提高人体抗病能力具有一定的功效。

多糖是一类大分子物质，具有多种重要生物活性，如抗氧化[5]、抗病毒[6]、抗肿瘤[7]、抗衰老[8]、降血糖血脂[8]、调节免疫力[10]等作用，因此被广泛应用于食品、发酵、医药和化妆品等领域。张素斌等[11]用热水提取法、单一酶法、超声波法对虫草花多糖进行提取，并比较几种提取方法的提取条件，在最佳提取条件下，热水提取法、纤维素酶法、木瓜蛋白酶法和超声波法的多糖提取率分别为18.12%、15.01%、18.57%、13.34%；贾有青等[12]用超声波法提取虫草花多糖，确定了虫草花多糖较佳提取条件为料液比1∶40（g∶mL），超声时间30 min，超声温度50℃，在此条件下测得虫草花多糖提取率为4.85 g/100 g；李银花等[13]采用正交试验优化了超声辅助提取虫草花多糖的工艺条件为：超声温度80℃，超声功率140 W，超声时间为40 min，在此条件下测得虫草花多糖提取率为3.46%。

本研究以虫草花为试验材料，实验室自制蒸馏水为提取溶剂，在考察单因素超声功率、液料比、超声时间、超声温度试验的基础上，通过L9（34）正交试验优化超声波辅助提取虫草花多糖的工艺条件；同时以维生素C（vitamin C，VC）为阳性对照，就虫草花多糖对于·OH、1,1-苯基-2-苦肼基（1,1-diphenyl-2-picrlhydrazyl，DPPH）自由基的清除作用和还原能力进行研究，以期为深入研究虫草花多糖特性，进一步开发和利用虫草花中多糖类物质提供理论依据和科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

虫草花（Cordyceps militaris）：采自云南省楚雄市东华镇。虫草花依次用自来水、蒸馏水洗净、晒干，粉碎后过40目筛，得干粉。干粉经石油醚脱脂、脱色素处理后，50℃烘干，得去除色素和油脂的干粉，保存，备用。

葡萄糖标准品（纯度≥98%）：天津市优谱化学试剂有限公司；DPPH：上海蓝季科技发展有限公司；维生素C（vitamin C，VC）：昆山谱森实验室用品科技有限公司；其他化学试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

Alpha-1502紫外可见分光光度计：上海谱元仪器有限公司；SK8210HP型超声波清洗器：上海科导超声仪器有限公司；CP224C型电子天平：奥豪斯仪器有限公司；SHZ-III A型循环水真空泵：巩义市予华仪器有限责任公司；HWS-26型电热恒温水浴锅：上海一恒科学仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 虫草花粗多糖的制备

准确称取1.0 g处理过的虫草花干粉，放入250 mL锥形瓶中，加入30 mL蒸馏水，在超声温度45℃，超声功率300 W的超声波中提取30 min，提取完毕后，用循环水真空泵抽滤，取上层滤液用Sevag法[14]脱除蛋白后，提取溶液加入3倍体积分数为95%的乙醇，将沉淀在50℃条件下进行干燥处理，得到虫草花粗多糖。

1.3.2 虫草花多糖含量测定

虫草花多糖含量测定采用苯酚-硫酸法[15]。以葡萄糖标准溶液质量浓度（x）对吸光度值（y）进行线性回归，得葡萄糖标准曲线回归方程y=10.797x+0.0149，相关系数R2=0.9995。虫草花多糖提取率计算公式如下：

式中：C为根据回归方程计算出的多糖质量浓度，mg/mL；N为稀释倍数；V为虫草花提取液定容的体积，mL；M为虫草花干粉的质量，g。

1.3.3 虫草花多糖提取工艺优化单因素试验

以多糖提取率为评价指标，分别考察以下单因素的影响：①超声波功率分别为200W、250W、300W、350W、400W的条件下进行提取，液料比30∶1（mL∶g），超声时间30 min，超声温度40 ℃；②液料比分别为10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1（mL∶g）的条件下进行提取，超声波功率300 W，超声时间30 min，超声温度40℃；③超声时间分别为10 min、20 min、30min、40min、50min的条件下进行提取，液料比30∶1（mL∶g），超声波功率300W，超声温度40℃；④超声温度分别为30℃、35℃、40℃、45℃、50℃的条件下进行提取，超声时间30min，超声功率300 W，液料比30∶1（mL∶g）。

1.3.4 虫草花多糖提取工艺优化正交试验

根据单因素试验筛选结果，采用L9（34）正交设计，以虫草花多糖提取率为评价指标，考察超声功率（A）、液料比（B）、超声时间（C）和超声温度（D）4个因素对虫草花多糖提取率的影响，正交试验因素及水平见表1。

表1 虫草花多糖提取工艺优化正交试验因素与水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for extraction technology optimization of Cordyceps militaris polysaccharides

1.3.5 虫草花多糖抗氧化性测定

将虫草花粗多糖分别配制成质量浓度为0.0029mg/mL、0.0058mg/mL、0.0087mg/mL、0.0116mg/mL、0.0147mg/mL的溶液，研究其抗氧化性。

（1）虫草花多糖对·OH的清除作用测定

·OH的清除能力测定参考陈晓宁等[16]的方法稍作修改。取2.0 mL虫草花多糖溶液于25 mL比色管，依次加入FeSO4（6 mmol/L，2.0 mL），水杨酸-乙醇溶液（6 mmol/L，2.0 mL）和H2O2（7 mmol/L，2.0 mL），在35℃水浴中反应25 min后，在波长536 nm处测定吸光度值记为A1；同法测定A2和对照液A0的吸光度值。同时，以相同质量浓度的维生素C溶液作阳性对照，羟基自由基清除率计算公式如下：

式中：A0为空白对照液的吸光度值（蒸馏水代替样品）；A1为样品的吸光度值；A2为对照组（蒸馏水代替H2O2）的吸光度值。

（2）虫草花多糖对DPPH·的清除作用测定

DPPH·的清除能力测定参考ALONSO A M等[17]的方法稍作修改。分别取2.0 mL不同质量浓度（0.002 9 mg/mL、0.0058mg/mL、0.0087mg/mL、0.0116mg/mL、0.0147mg/mL）的虫草花多糖溶液，加入DPPH-乙醇溶液（0.1 mmol/L，2.0 mL），混匀，室温条件下避光反应15 min后，并在波长517 nm处测定吸光度值。同时，以相同质量浓度的维生素C溶液作阳性对照，DPPH自由基清除率计算公式如下：

式中：A0为样品被蒸馏水代替时测定的吸光度值；A1为测定样品虫草花多糖溶液的吸光度值；A2为采用乙醇替换DPPH-乙醇溶液时样品的吸光度值。

（3）虫草花多糖还原能力的测定

还原能力的测定参考魏明等[18]的方法稍作修改。在5支比色管中分别加入不同质量浓度（0.0029mg/mL、0.0058mg/mL、0.008 7 mg/mL、0.011 6 mg/mL、0.014 7 mg/mL）的虫草花多糖溶液1.0 mL，依次加入磷酸缓冲液（pH=6.6，0.2 mol/L，2.0 mL），铁氰化钾溶液（1.0 g/mL，2.0 mL），混匀，在50℃的水浴中恒温20 min后，冷却至室温后加入三氯乙酸溶液（0.1 g/mL，2.0 mL）摇匀。取2.0 mL反应液于比色管中，依次加入2.0 mL蒸馏水和三氯化铁溶液（1.0 g/mL，0.4 mL），室温下反应15min后，在波长700 nm处测定吸光度值（A700nm），以吸光度值（A700nm）的大小来衡量还原能力的强弱，吸光度值越大，还原能力越强。以蒸馏水代替样品溶液为空白对照，以相同质量浓度的维生素C溶液作阳性对照，每组试验平行进行3次。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 超声功率对虫草花多糖提取效果的影响

由图1可知，虫草花多糖提取率随着超声波功率在200～400 W范围内的增加先增大后降低。超声功率为300 W时，虫草花多糖提取率达到最大值为3.82%。这可能是超声波功率大，所具有的能量较大，从而加速虫草花中多糖的溶出；但当超声波功率太大时，可能会破坏多糖的结构，导致提取率下降。因此，确定适宜的超声功率为300 W。

图1 超声波功率对多糖提取效果的影响Fig.1 Effect of ultrasonic power on the polysaccharides extraction effect of polysaccharides

2.1.2 液料比对虫草花多糖提取效果的影响

由图2可知，随着液料比在10∶1～50∶1（mL∶g）范围内的增大，虫草花多糖提取率呈先增大后减小的趋势，当液料比达30∶1（mL∶g）时，多糖提取率达到最大为3.84%。这可能是溶剂用量的增大使细胞内外浓度差增大，从而提高多糖提取率；当液料比继续增大时，多糖提取率减小，这可能是溶剂用量的增大，消耗更多的能量[19]。因此，确定适宜的液料比为30∶1（mL∶g）。

2.1.3超声时间对虫草花多糖提取效果的影响

图2 料液比对多糖提取效果的影响Fig.2 Effect of liquid to solid ratio on the polysaccharides extraction effect of polysaccharides

由图3可知，超声时间在10～30min范围内，虫草花多糖的提取率随超声时间的延长而增大，当超声时间为30 min时，提取率达到最大为3.81%；之后随超声时间的继续增加，虫草花多糖的提取率逐渐减小。这可能是因为在超声波的过程中会产生大量的热能，并且随着时间增加，产生的热能就越多，当热能超过一定的限度时，就会破坏多糖的分子结构，使得提取率降低[20]。因此，确定适宜的超声时间为30 min。

图3 超声时间对多糖提取效果的影响Fig.3 Effect of ultrasonic time on the extraction effect of polysaccharides

2.1.4 超声温度对虫草花多糖提取效果的影响

由图4可知，随着超声波提取温度的升高，虫草花多糖提取率逐渐增大，当超声波温度达到40℃时，虫草花多糖提取率达到最大为3.85%；之后继续升高超声波提取温度，虫草花多糖提取率呈现下降。这可能是随着提取温度的升高，多糖分子运动加快，同时可以增加溶剂的渗透能力，提取率随之升高，但是过高的温度可能会对多糖分子结构和生物活性产生破坏作用[21]。因此，确定适宜的超声温度为40℃。

图4 超声温度对多糖提取效果的影响Fig.4 Effect of ultrasonic temperature on the extraction effect of polysaccharides

2.2 提取工艺正交试验结果

由表2可知，影响虫草花多糖提取率的主次顺序依次为D＞B＞A＞C，即超声温度＞液料比＞超声功率＞超声时间。虫草花多糖的最佳提取工艺参数为A2B2C2D3，由于正交试验中没有出现A2B2C2D3最佳组合，因此在该件下进行3次平行验证试验，测得虫草花多糖平均提取率为3.88%，高于正交试验中的组合，因此选择最佳提取工艺参数为超声功率为300 W，液料比为30∶1（mL∶g），超声时间为30 min，超声温度为45℃。

表2 虫草花多糖提取工艺优化正交试验结果与分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for extraction technology optimization of Cordyceps militaris polysaccharides

2.3 虫草花多糖抗氧化性分析

2.3.1 虫草花多糖对·OH的清除能力

虫草花多糖对·OH清除效果随浓度变化见图5。由图5可知，虫草花多糖在质量浓度0.002 9～0.014 7 mg/mL范围内，随着虫草花多糖质量浓度的增加，清除·OH的能力增强。当多糖质量浓度为0.0147mg/mL时，对·OH的清除率可达到44.39%，与阳性对照液维生素C对·OH的清除率53.55%相比稍弱，但虫草花多糖仍然表现出较强的清除·OH的能力。

图5 不同质量浓度虫草花多糖对·OH的清除效果Fig.5 Scavenging effect of different concentration of polysaccharides in Cordyceps militarison·OH

2.3.2 虫草花多糖对DPPH·的清除能力

虫草花多糖对DPPH·清除效果随质量浓度变化见图6。由图6可知，虫草花多糖在质量浓度0.002 9～0.014 7 mg/mL范围内，随着虫草花多糖质量浓度的增加，清除DPPH·的能力增强。当虫草花多糖质量浓度为0.0147 mg/mL时，对DPPH·的清除率可达到56.34%，与阳性对照液维生素C对DPPH·的清除率72.47%相比较弱，但虫草花多糖依然表现出一定的清除DPPH·的能力。

图6 不同浓度虫草花多糖对DPPH·的清除效果Fig.6 Scavenging ability of different concentration of polysaccharides in Cordyceps militarison DPPH·

2.3.3 虫草花多糖的还原能力

虫草花多糖还原能力随浓度变化见图7。由图7可知，虫草花多糖在质量浓度0.002 9～0.014 7 mg/mL范围内，虫草花多糖还原能力随质量浓度的增加而增强，但与阳性对照液维生素C的还原能力相比稍弱，但虫草花多糖依然表现出有良好的还原能力，从而证明了其较好的抗氧化活性。

图7 不同浓度虫草花多糖的还原能力Fig.7 Reducing capacity of different concentration of polysaccharides in Cordyceps militaris

3 结论

在单因素试验的基础上，通过正交试验获得了超声波辅助提取虫草花多糖的最佳工艺条件为：超声功率为300W，液料比为30∶1（mL∶g），超声时间为30min，超声温度为45℃。在此优化条件下，测得虫草花多糖平均提取率为3.88%。

抗氧化性试验结果表明，虫草花多糖在质量浓度0.0029～0.014 7 mg/mL范围内，·OH和DPPH·的清除能力与多糖质量浓度呈正相关性。当多糖质量浓度为0.0147 mg/mL时，对·OH和DPPH·的清除率可分别达到44.39%和56.34%，与阳性对照液维生素C对·OH（清除率53.55%）和DPPH·（清除率72.47%）的清除率相比稍弱，但虫草花多糖仍然表现出较强的清除·OH和DPPH·的能力；虫草花多糖的还原能力也随质量浓度增大而增强，与同质量浓度阳性对照液维生素C的还原能力相比稍弱，但虫草花多糖也同样表现出良好的还原能力，说明虫草花多糖具有较强的抗氧化活性。