8个反季节秀珍菇菌株栽培性状评价与遗传差异分析

陈雪凤，郎 宁，韦仕岩，吴圣进，王灿琴，吴小建，苏启臣，蓝桃菊

(广西农业科学院微生物研究所，广西 南宁 530007)

【研究意义】秀珍菇(Pleurotusgeesteranus)在分类学上属于真菌门、担子菌纲、伞菌目、侧耳科、侧耳属、肺形侧耳种，商品名或俗称凤尾菇。秀珍菇菌株类型繁多，根据出菇温度分为高温型品种和低温型品种；根据出菇是否需要温差刺激可分为自然出菇型秀珍菇和需要温差刺激出菇的反季节秀珍菇。反季节秀珍菇即是通过制冷设施低温温差刺激，能在夏季出菇的秀珍菇品种。由于反季节秀珍菇有出菇整齐，潮次明显，产量高，能根据市场需求量控制出菇，进行集约化栽培等诸多优点，因此栽培规模逐年扩大。据2017年统计，广西有30万袋生产规模的企业约20多家，年产菌棒约2800万袋，菌种需求量高达71万袋。然而，目前广西栽培的反季节秀珍菇种源比较混乱，交叉引种现象较多，异种同名或同种异名现象频发，加上引种后扩繁不规范，造成质量、产量和抗病性不稳定，严重影响了产业的发展。为了更好的鉴别秀珍菇种源之间的亲缘关系并筛选出高产、优质的反季节秀珍菇菌株，从分子生物学和传统农艺性状角度对不同来源的秀珍菇菌株进行综合评价尤为重要。【前人研究进展】有关秀珍菇品种筛选评价方面的研究报道较多。闫静等[1]通过比较11个菌株的菌包污染率、菌丝长速、产量、子实体品质等栽培特性，筛选出罗源秀珍、秀珍188、秀珍195等适合夏季设施化栽培的菌株。陆娜等[2]通过比较36个菌株的产量、子实体商品性状、出菇密度、成品率等，筛选出产量高、菇体灰色、出菇密和成菇率表现好的秀57菌株。林原[3]通过比较10个菌株的生物学效率、农艺性状，筛选出菌盖小厚，菌柄粗短、商品性好的秀63菌株。王灿琴等[4]通过比较13个菌株的菌丝的生长情况、栽培农艺性状、生物学效率、抗青霉等情况，筛选出表现较好的5个优良菌株(HX13、HX14、HX10、HX8、HX9)。吴登等[5]通过比较7个秀珍菇菌株的菌丝体的生长情况、出菇温度范围、子实体经济性状、产量等，筛选出适宜利用桑枝屑栽培的优良菌株秀珍3号。由此可见，在秀珍菇品种筛选栽培评价中，多数科研者注重从产量、子实体商品性状、菌丝生长方面进行秀珍菇菌株比较评价，但从菌丝生长后期是否吐黄水及黄斑病抗病性方面评价的较少。关于利用ISSR技术进行秀珍菇遗传差异方面的研究，冯伟林等[6]利用ISSR技术开展15个秀珍菇多样性分析，结果当遗传系数为0.87时菌株聚为3个群，同时初步发现秀珍菇不同出菇温型与ISSR分子标记分类有相关性。陆娜等[2]对36个秀珍菇菌株进行遗传差异分析，结果36个秀珍菇菌株聚为7个群，遗传差异较大。林原等[7]对7个秀珍菇菌株进行了ISSR遗传分析，发现7个菌株存在一定的差异。由此可见ISSR技术可用作秀珍菇种内菌株间的亲缘性鉴定，但前人比较分析的秀珍菇菌株为广泛收集的菌株，没有针对性地对某一特性的秀珍菇菌株进行遗传多样性分析，且农艺性状与ISSR分子标记相关性的发现较少。【本研究切入点】国内有关秀珍菇品种选育、评价、遗传多样性分析的研究报道较多，但是专门针对需要温差刺激出菇的反季节秀珍菇的种质资源评价及遗传多样分析鲜有报道。【拟解决的关键问题】结合菌丝生长、出菇情况、子实体性状和抗病性进行菌株评价；通过菌株DNA的ISSR-PCR产物扩增检测及聚类分析以判定菌株之间的亲缘关系，综合多个栽培性状，筛选出表现较优良的菌株，为栽培生产及育种提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试菌株与来源

供试菌株与来源见表1。

1.2 栽培培养料配方

栽培袋配方：棉籽壳20 %、桑枝30 %、木屑30 %、麦麸18 %、轻钙1 %和石灰1 %。

PDA加富培养基：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、蛋白胨3 g、琼脂20 g和水1000 mL。

1.3 试剂及引物

所用基因组DNA提取试剂盒、引物、PCR反应体系和Marker DL 2000均购自康为世纪公司，所用引物的名称及核苷酸序列见表2。8 % PAGE实验试剂：29∶130 %双甲叉丙烯酰胺、5XTBE、ddH2O、TEMED和10 %过硫酸铵。

1.4 出菇试验

按栽培秀珍菇的常规方法生产菌包，使用17.00 cm×33.00 cm×0.05 cm的聚乙烯塑料袋装袋，每个菌株接种100袋，设3个重复，菌袋接种后置于25～27 ℃培养室培养60 d，菌丝成熟后按常规方法进行出菇管理，出菇冷刺激温度为10 ℃。

1.5 评价观测方法

1.5.1 菌丝情况观测 在秀珍菇菌丝菌龄为60和80 d时分别观察菌包袋口附近菌丝是否吐黄水和出现自然出菇现蕾情况。

1.5.2 出菇情况观测 观察冷刺激后现蕾时间，出菇整齐度：冷刺激后2～3 d观察，85 %以上的菌包现蕾出菇，而且菇蕾比较整齐且多，为整齐(+++)；50 %～85 %菌包现蕾，但菇蕾不整齐，菇蕾少，为一般整齐(++)；30 %～50 %菌包现蕾，但菇蕾不整齐，菇蕾少，为不整齐(+)；30 %以下的菌包现蕾或不现蕾且菇蕾少，为难出菇(0)。采收前4～5潮菇，计算生物学转化率(%)=(鲜菇重/干料重)×100，并进行统计分析。

表1 供试秀珍菇菌株

表2 ISSR引物序列

1.5.3 子实体性状观测 第1潮菇采收时，每个品种随机抽取30～50朵鲜菇，进行子实体性状测定。子实体厚度：用游标卡尺测量菌盖中心厚度。子实体菌盖大小：用游标卡尺“十”字形测量菌盖直径；菌柄直径：测量菌柄中部直径。菌柄长度：测量菌褶与菌柄交界处至菌柄基部的距离；子实体颜色深浅度：灰褐色、灰黑色和灰白色。

1.5.4 黄斑病发病情况调查和分级标准 第1潮菇采收前，统计全部菌包的黄斑病发病率—即统计全部出菇袋数，并统计有黄斑病发生的袋数。每个品种随机调查15袋3个重复，每个重复5袋子实体，调查直径1.5 cm以上的全部子实体病情情况，病害调查分级标准见表3。根据分级标准计算病情指数[8-9]。

1.6 遗传差异分析

1.6.1 菌丝培养与DNA提取 将不同菌株的菌丝块接种到PDA加富培养基的平皿上，于27 ℃培养6～8 d，用解剖刀刮取菌丝。使用DNA提取试剂盒对收集的菌丝进行DNA提取，并用1 %琼脂糖凝胶电泳检测质量，质量合格的DNA储藏于-20 ℃冰箱备用。

1.6.2 ISSR-PCR扩增及电泳 试验用ISSR引物见表2所示，PCR扩增反应体系(25 μl)：2×EsTaqMasterMix(Dye) 12 μl，ddH2O 11 μl，引物 (10 μmol/L) 1 μl，DNA模板1 μl。按上述比例将反应液加入PCR管并混合均匀，进行PCR扩增。PCR反应条件：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，45～55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35个循环，最后72 ℃终延伸10 min，16 ℃保存30 min。 PCR产物在8 % PAGE胶上120 V，5.0 h电泳检测。

1.6.3 银染 电泳结束后，自来水冲洗玻璃板两面，预冷，剥下凝胶，双蒸水洗涤2次。将PAGE胶浸没于0.1 % 的AgNO3溶液中，摇床银染10 min，然后用双蒸水冲洗2次，每次不超过10 s。再将PAGE胶浸没于1.2 % NaOH+ 0.4 %甲醛溶液中显影，看到模糊的条带后立即用大量双蒸水冲洗，中止显影。

1.6.4 数据分析 将ISSR图谱用扫描仪扫描并进行ISSR扩增片段统计，有ISSR带谱记为1，无ISSR带谱记为0，用聚类分析软件NTSYS-PC 2.1计算遗传相关系数，进行聚类分析，得出聚类图谱。

表3 秀珍菇黄斑病的分级标准

注：病情指数(K)公式为：K={∑[k1×n1]/(n×k2)}×100，式中：k1为病害级数值；n1为对应各级发病子实体数；n为调查总子实体数；k2为病害最高级数值。

Note: Disease index(K)={∑[k1×n1]/(n×k2)}×100.k1is the representative value of disease;n1is the quantity of the fruit body corresponding to each grade of disease;k2is the highest value of the grade disease.

表4 8个供试秀珍菇菌株栽培出菇情况对比

注：同列数据中大写字母表示不同菌株在0.01水平上差异显著，下同。

Note: Capital letters in the same row indicate significant difference at 1 % level among different strains. The same as below.

2 结果与分析

2.1 农艺性状评价

2.1.1 菌丝及出菇情况 从菌丝生长后期是否吐黄水来看，只有台秀2号容易吐黄水，其余7个菌株后期没有吐黄水；从是否需要大温差刺激出菇方面来看，秀珍12菌包长满后气温低于25 ℃以下就可以自然出菇，而其他菌株则需要有较低的温度刺激方能出菇；在正常出菇管理下观察8个菌株黄斑病的自然发生情况发现：秀珍P-4发病最为严重，发病率为58.53 %，说明其抗黄斑病能力较差，其他7个菌株发病率较低；从冷刺激后现蕾快慢来看，台秀57(农)、台秀2号、秀珍P-4、台秀(天达)、广温秀珍现蕾较快，需2.5 d；秀珍P-6、秀珍12、秀珍13现蕾稍慢，需要2.5～3 d。出菇最整齐是台秀57(农)、台秀2号、台秀(天达)和广温秀珍，其次是秀珍P-4、秀珍P-6、秀珍13，整齐度最差的是秀珍12；从生物学转化率方面分析，生物学转化率最高的是台秀(天达)，为73.67 %，其次是台秀57(农)，转化率为68.93 %，最差的是秀珍P-4，生物学转化率只有25.90 %。综合以上情况的分析比较，可以淘汰吐黄水的台秀2号、容易自然出菇、出菇不整齐的秀珍12和产量低抗病差的秀珍P-4(表4)。

2.1.2 子实体主要性状 8个秀珍菇菌株子实体颜色大致分为灰黑色、灰褐色和灰白色3类，其中灰黑色菌株4个，灰褐色菌株1个，灰白色菌株3个；子实体厚度、菌柄直径可分为3类：菌盖厚、菌柄粗的台秀57(农)等4个菌株为一类，菌盖薄、菌柄细的秀珍12为一类，其余的3个菌株为一类；子实体单个重量基本上与菌盖厚度、菌柄粗细及菌盖直径正相关。结合市场需求，颜色深的灰黑色品种，以及菌盖厚的品种较受欢迎，因此可淘汰秀珍12、秀珍13、秀珍P-4。而台秀(天达)除了颜色稍微偏白外，其他各项性状均优良，因此可以作为今后的育种材料(表5)。

表5 供试8个秀珍菇菌株子实体性状对比

M、1、2、3、4、5、6、7、8分别代表Marker DL 2000、秀珍 12、台秀 57(农)、秀珍 P-6、广温秀珍、秀珍 P-4、秀 珍13、台秀(天达)、台秀 2 号M,1,2,3,4,5,6,7,8 respectively represent Marker DL 2000, Xiuzhen12, Taixiu57nong, Xiuzhen P-6, Guangwenxiuzhen, Xiuzhen P-4, Xiuzhen13, Taixiutianda and Taixiu2图1 引物7、8、9、11、12、27、34、36、42对秀珍菇8个供试菌株扩增的ISSR电泳图谱Fig.1 ISSR electrophoretogram of tested strains of P. pulmonarius based on primers 7, 8, 9, 11, 12, 27, 34, 36 and 42

2.2 秀珍菇ISSR标记分析

2.2.1 电泳图谱统计分析 使用18个ISSR通用引物对8个秀珍菇菌株进行分析，共计扩增出361条清晰易辩的条带，扩增的DNA片段条带的大小为150～2000 bp，多态性片段为304条，多态性比例为84.21 %。其中引物7、8、9、11、12、27、34、36和42扩增片段如图1所示。

2.2.2 DNA扩增图谱聚类分析 秀珍菇菌株的遗传关系图谱见图2。由ISSR聚类图上可以看出8个菌株遗传相似性水平为0.59～0.77，在0.59水平上8个菌株聚为2个群，秀珍12单独为一类，其他7个菌株为一类，说明秀珍12其他7个菌株亲缘关系较远。系数为0.68时为4个群，秀珍12为GroupⅠ；台秀57(农)、台秀2号和广温秀珍为Group Ⅱ；秀珍P-6为Group Ⅲ；秀珍P-4、台秀(天达)和秀珍13为Group Ⅳ。但系数为0.77时台秀57(农)与台秀2号为一组，说明8个菌株中台秀57(农)与台秀2号遗传关系最近。

3 讨 论

3.1 秀珍菇菌株遗传多样性

种质资源遗传多样性是农艺性状、细胞学、生物化学及分子遗传标记等方面多样性的综合体现[10]。秀珍菇在栽培过程中，常常会受到温度、光照等因素的影响，外观形态出现差异，传统的子实体形态容易受环境因素影响，品种菌株间难以区分。而ISSR检测手段简单、高效，常用于揭示食用菌遗传多态性和区分种内菌株间亲缘关系，是一种快速、可靠的工具[11]。冯伟林等[6]、 陆娜等[2]和林原等[7]利用ISSR技术对其所收集的菌株开展秀珍菇多样性分析，均得出菌株之间存在一定的差异。但3位研究者所研究的秀珍菇菌株是广泛收集的秀珍菇菌株，并没有针对性地对某一类秀珍菇菌株进行多样性分析。在农艺性状与ISSR分子标记相关性上，只有冯伟林等发现农艺性状中出菇温度与ISSR分子标记有相关性。本研究利用ISSR技术对8个秀珍菇菌株开展多样性研究分析，根据菌株DNA的扩增片段进行聚类分析，8个菌株遗传相似性水平为0.59～0.77，得出菌株之间遗传有差异，在遗传相似系数0.59时8个菌株聚为2个群，即不需要大温差刺激出菇的秀珍12单独为一类，其他7个需要大温差刺激出菇的菌株为另一类，说明这两类菌株亲缘关系较远。可见ISSR分子技术能明显将需要大温差刺激出菇的品种与不需要温差刺激的品种区分出来，说明出菇温差型与ISSR分子标记分类相关性较高，这与冯伟林发现的“秀珍农艺性状中出菇温度与ISSR分子标记有相关性” 的研究结果相近。本研究还发现，遗传系数为0.68时，秀珍P-4、秀珍13、台秀(天达)3个灰白色菌株聚为一类，这说明秀珍菇的颜色农艺性状与分子标记也有一定的相关性，但具体情况还有待研究。

图2 以18个ISSR引物扩增的8个秀珍菇菌株聚类分析图Fig.2 Cluster analysis diagram of the tested 8 P. pulmonarius strains based on 18 ISSR primers

3.2 秀珍菇菌株农艺性状比较

创造优良性状，特别是聚合多个优异农艺性状是育种的主要目标。食用菌农艺性状的好坏能直接反映出菌株是否优良。在实际工作中，科研生产者最为关注的农艺性状是丰产性、抗逆性、菌丝长势、适应性及子实体的商品性状(颜色、外形和质地)等相关性状[11]。闫静等[1]、陆娜等[2]、林原等[3]及王灿琴等[4]从菌丝长势、产量、子实体商品性等方面进行秀珍菇菌株农艺性状的比较，筛选较好的菌株[1-4]。陈丽新等[12]、曹本雄等[13]、吴登等[5]从基质适应性方面进行菌株的比较，筛选出适合桉树皮、桑枝屑、木薯杆屑栽培的秀珍菇菌株。而本研究则根据市场及栽培者的需求，除了从产量、出菇快慢、整齐度和子实体商品性状进行农艺性状比较外，还从菌丝后期是否容易吐黄水、黄斑病抗病性等抗逆性方面进行比较评价，筛选出优良菌株。

抗逆性是食用菌优良品种必备的重要性状，它直接关系到栽培的成败和经济效益[11]。抗逆性包括抗病性、抗虫性、抗高温性、耐碱性等。反季节秀珍菇在栽培中很容易发生黄斑病。秀珍菇感染黄斑病后，子实体变黄、腐烂，出现黏稠状分泌物，伴有恶臭味，并蔓延至整丛子实体，使得产品失去商品价值。据调查，头潮菇黄菇病发生率一般为9.4 %～20.8 %，高的达62.6 %，严重的甚至整个菇房100 %菌包发病[14]。因此黄斑病抗性应作为秀珍菇的农艺性状评价的一个重要性状指标。但在秀珍菇种源评价中，对抗病性的比较评价鲜有报道。本研究采取发病率及病情指数双重评价指标对供试菌株黄斑病的发病程度进行评判，更加科学可靠。对于秀珍菇黄斑病，目前国内没有该病害调查的分级标准，本研究通过参考农作物病害的分级方法结合秀珍菇黄斑病发生特点，制定了黄斑病调查方法。该方法将有助于今后进行秀珍菇黄斑病的抗病性鉴定评价。

4 结 论

通过品比试验及遗传多样分析，综合产量、菇体颜色、感黄斑病、菌丝吐黄水等情况，初步选出各项栽培性状均表现较好的台秀57(农)菌株，可以进行栽培推广；秀珍P-6、广温秀珍、台秀(天达)菌株可做育种材料。