25个鸡品种DMB2基因序列比较分析

刘本帅，郑圣晗，原小雅，陈 颖，张 莘，王统苗，陈博雯，张 扬，王志秀，常国斌，陈国宏

(扬州大学动物科学与技术学院，江苏 扬州 225009)

【研究意义】主要组织相容性复合体(MHC，major histocompatibility complex)分子是一种受体多基因家族，其功能是结合并提呈抗原肽给T细胞。许多不同种类的MHC基因都具有同源性，它们来自于同一个原始基因区，在进化过程中，随着环境和条件的变化，基因具有不同的分化方式，这样同一MHC基因区可形成不同的基因产物，从而使MHC有许多种不同的等位基因[1]。MHC II 类分子就是其中之一，其主要分布于抗原递呈细胞(Antigen-presenting cell, APC)表面, 递呈经过处理的外源性抗原肽供CD4+ T细胞识别, 通过辅助性T细胞, 激活抗体免疫应答[2]。【前人研究进展】在小鼠中免疫增强衣原体特异性免疫应答而开发了沙眼衣原体纳米抗体(PPM)的报到中提到CD4 +细胞都可以在小鼠中提供抗衣原体免疫[3]。DMB2基因是鸡MHC基因家族II类一个典型基因座，其基因编码产物是抗原分子，对鸡的免疫调控起着重要作用。一般情况下MHC基因在动物物种内呈高度多态性。由核苷酸发生替换而形成的多态性有利于MHC分子与多种抗原肽的结合[4]。MHCII类分子是由α(DMA)和β(DMB)链组成的异二聚体，它位于细胞内囊泡[5]。MHC II类分子表达的增加可能会改变胸腺发育过程中的T细胞受体库，并影响成熟T细胞的存活和扩增。许多证据证实，转录和转录后调节的水平参与调节MHC II类基因的表达，并且都促成了自身免疫性疾病的倾向[6]。【本研究切入点】DM通过帮助从肽结合位点释放CLIP(II类相关恒定链肽)分子而在MHC II类分子的肽加载中起核心作用。可见DMB2基因在鸡的免疫反应中起着不可或缺的作用。但是不同鸡DMB2基因序列特征及其表达特性的研究较少。【拟解决的关键问题】本研究以25个常见鸡种为研究素材，利用目标序列捕获方法对DMB2基因进行SNPs、Indels分析，为探明该基因的遗传特性以及家禽的抗病育种提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 鸡品种来源及DNA提取方法

本研究共选取25个鸡品种：其中白耳鸡(BE)、茶花鸡(CH)、大骨鸡(DG)、斗鸡(DJ)、固始鸡(GS)、狼山鸡(HL)、鹿苑鸡(LU)、泰和乌骨鸡(WG)、仙居鸡(XJ)、萧山鸡(XS)、北京油鸡(YJ)、藏鸡(ZJ)等12个地方鸡种来自于中国农业科学研究院家禽科学研究所，红色原鸡(HY)采自云南省野生动物救护中心，安卡鸡(AK)、广西黄鸡(GX)、 SPF-来航鸡(SPF-LH)、东乡绿壳蛋鸡(LK)、罗斯鸡(LS)、溧阳鸡(LY)、青脚麻鸡(QJ)、如皋黄鸡(RG)、太湖鸡(TH)、文昌鸡(WC)、雪山鸡(XC)、隐性白羽鸡(YB)等12个鸡种来自扬州大学动物科学与技术学院遗传资源实验室禽种资源基因库。每个鸡种随机选取10羽鸡，翅下静脉采血2 mL，然后放入具有肝素钠的采血管中，加入裂解液，用苯酚和氯仿抽提法提取DNA，4 ℃冷藏保存。

1.2 DMB2基因序列对比分析及构建系统发育进化树

将DNA样品送深圳华大基因公司进行目标序列捕获测序。利用MEGA6软件对25个鸡种进行核苷酸序列对比分析，统计核苷酸突变位点和插入缺失位点以及氨基酸变化位点，最后利用MEGA6软件运用邻接法(Neighbour Joining)构建系统发育进化树(Phylogenetic tree)。

2 结果与分析

2.1 不同鸡种中DMB2基因SNPs位点及Indels位点统计

使用MEGA6软件比对26段不同鸡品种的DMB2基因序列(包括参考序列)后发现，如表1所示，DMB2基因在25个鸡种中共有281个SNPs和Indels位点，但是主要位于内含子上。其中1、4外显子和5内含子没有SNPs位点，其余外显子上有较少的SNPs和Indels位点。可见DMB2基因有较高的保守性。

2.2 DMB2基因外显子SNPs位点分布

由表2可知，25个鸡种中，斗鸡、仙居鸡、萧山鸡、太湖鸡等十种没有SNPs位点，各品种总体上SNPs位点都较少且比较集中，而只有SPF-来航鸡的SNPs位点相对较多，表明各DMB2基因是序列比较保守的一类。而部分突变位点未导致了氨基酸变化，这表明DMB2基因在各种鸡中的表达效果相似。说明DMB2基因在不同鸡品种中起着相同的免疫特点。本研究发现各种鸡的 SNP 位点均较少，说明各DMB2基因是序列的保守性很高。这也间接说明这类基因在免疫防御方面具有重要的作用。

表1 不同鸡种中DMB2基因外显子和内含子SNP和Indels分布情况

表2 DMB2基因在不同鸡种中突变分布和氨基酸的变化

经比对，25个不同鸡种中Indels位点均存在于内含子上，由表3可见，共有22个鸡种在内含子4上发生基因插入，只有固始鸡、绿壳蛋鸡、隐性白羽鸡未发生突变。比较特别的是只有在泰和乌骨鸡内含子2上有一段较长的缺失。虽然这些插入和缺失都发生在内含子上，但是这可能会导致DMB2基因翻译产物发生改变。

表3 不同鸡种DMB2基因InDels分布

注：D和I分别表碱基缺失和插入，后面带的数字表示碱基数，即I1表示有1个碱基插入。

Note: D and I base loss and insertion, respectively, followed by a number that base number, that is, I1 said a base insert.

图1 不同鸡品种DMB2基因NJ系统进化树Fig.1 Different chicken breeds DMB2 gene NJ phylogenetic tree

2.3 DMB2基因进化树分析

不同鸡种DMB2基因表现出一定的保守性，为了进一步探究不同鸡种DMB2基因同源性，我们对26个鸡种用MEGA6软件构建NJ(Neighbour-Joining)进化树，探究其同源性。如图2所示，树枝的长度代表了树的距离，树枝上显示Bootstrap 1000个循环设置的置信度。由图知26个鸡种分为5大类，我国南方优良地方品种太湖鸡、茶花鸡、狼山鸡、红色原鸡来自同一条分支；国外品种罗斯鸡、隐性白羽鸡与固始鸡、鹿苑鸡、仙居鸡来自同一条分支；抗病性较强的广西黄鸡、SPF-来航鸡、藏鸡、雪山草鸡来自同一条分支。上述结果表明，不同类型的地方鸡种同源性较小，我国不同地方鸡种DMB2基因在进化过程形成了其特有的免疫特点。

3 讨 论

MHC基因是脊椎动物多态性最高的基因。而作为其典型基因座DMB2基因却呈现出一定的保守性。在哺乳动物中，DM分子在其表达于细胞表面之前参与经典II类肽复合物的形成。已经显示，没有DM这些复合物是不稳定的，破坏抗原呈递。位于小鼠MHC的Pb和Ob基因之间的3个新基因(DMA，DMB1和DMB2)具有表明它们是MHC II类基因家族的成员的性质，但是它们是迄今为止鉴定的最不相同的II类成员[7]。几乎所有关于哺乳动物外MHC II类分子的结构和功能的知识都来自对鸡的研究。大部分与II类系统有关的基因存在于鸡中，因此抗原加工和肽加载机制可能与哺乳动物相似[8]。因此对鸡的MHC II类基因的研究显得尤为重要。与导致MHC I类分子的肽装载的相对充分表征的途径相比，关于MHC II类的抗原加工和呈递知之甚少。II类获得肽的位置是有争议的，并且还不清楚在抗原递呈细胞中II类肽结合所需要的成分[9]。

鸡中存在3种DM基因：DMA，DMB1和DMB2。它们与哺乳动物DM基因同源并在各种免疫相关组织中表达。DM在鸡中的存在证明它们存在于原始MHC中的假设是成立的。DMA,DMB1和DMB2的mRNA存在于脾组织中，DMA的mRNA也可以从脑和法氏囊组织中扩增，DMB2的mRNA从脑，法氏囊和肺组织中扩增，没有从心脏组织获得扩增[10]。这说明DM基因主要在免疫器官表达。与导致MHC I类分子的肽装载的相对充分表征的途径相比，关于MHC II类的抗原加工和呈递知之甚少。II类获得肽的位置是有争议的，并且还不清楚在抗原递呈细胞中II类肽结合所需要的成分。尽管小鼠的两个DMB基因非常相似，然而鹌鹑和火鸡两个种类，在数据库中的DM序列，两个DMB基因似乎不太相似。Carrington等研究表明尽管在鸡中B-DM基因中多态性频繁，但是它们并不像在哺乳动物中所报道的经典的II类基因那样多[11]。 Atkinson等人的初步分析在保留DM分子推定的侧面的结论中得出结论，暗示如果这些位点是保守的，那么来自任何单倍型的经典II类分子将结合任何其他单元型的DM分子。这个假设与我们的结果是一致的，显示了DM分子的多态性总体低水平和特定结构域的保守性[12]。

本研究结果表明，DMB2基因序列上snps和Indels比较少，主要分布在Exon2上。Exon3、Exon6上也有少量snps和Indels，但是氨基酸表达上未发生变化。说明了DMB2基因有很高的保守性，这在MHC家族中是并不多见的，从侧面说明了DMB2基因是各种鸡必不可很少的。其中SPF-LH鸡在25种鸡中SNP是最多的，这可能与它们是国外鸡种，且生长速度快、性成熟早有关。进化树结果显示，太湖鸡、茶花鸡、狼山鸡、红色原鸡来自同一条分支，这些地方鸡种同样有着耐粗饲，抗逆性强的特点；国外品种罗斯鸡、隐性白羽鸡与固始鸡、鹿苑鸡、仙居鸡来自同一条分支，其共同特点是产蛋性能都比较好；广西黄鸡、SPF-来航鸡、藏鸡、雪山草鸡来自同一条分支，它们的雏鸡都有着抗病性强的特点。

4 结 论

我国各鸡种经过长期的进化过程表现出丰富的遗传多样性，各鸡种之间同源性较低。但是与大部分MHC家族基因不同的是各种鸡DMB2基因外显子上突变都比较少，该基因有着很高的保守性，说明在进化过程中DMB2基因是不可或缺的，DMB2基因在鸡免疫反应过程在起着重要作用。