铁蓄积对去势骨质疏松家兔骨代谢生化指标表达的影响

邝立鹏　谭伟源　陈军平　姚泽明　何勇槟

【摘要】 目的 探討铁蓄积状态对去势骨质疏松家兔骨代谢生化指标表达的影响。方法 30只8月

龄新西兰家兔， 随机分为对照组、去势组、铁蓄积去势组， 每组10只。去势组和铁蓄积去势组兔均行卵巢切除术， 铁蓄积去势组在卵巢切除后耳缘静脉注射蔗糖铁造模。比较三组兔造模后不同时间腰椎及右股骨骨密度（BMD）及兔骨代谢指标水平。结果 造模后20周， 铁蓄积去势组兔腰椎及右股骨BMD明显低于对照组及去势组， 去势组兔腰椎及右股骨BMD明显低于对照组， 差异有统计学意义（P<0.05）。造模后12、20周， 去势组、铁蓄积去势组兔血清抗酒石酸酸性磷酸酶5b（TRAP-5b）水平明显高于对照组， 血清骨碱性磷酸酶（BALP）水平低于对照组， 差异具有统计学意义（P<0.05）;铁蓄积去势组兔血清TRAP-5b水平（9.17±0.48）、（11.45±0.32）U/L明显高于去势组的（7.04±0.40）、（8.56±0.17）U/L， 血清BALP水平（18.87±1.72）、（15.16±0.72）U/L低于去势组的（22.62±1.63）、（19.72±0.43）U/L， 差异有统计学意义（P<0.05）。造模后12、20周， 去势组、铁蓄积去势组兔血清核因子κB受体活化因子配体（RANKL）水平高于对照组， 铁蓄积去势组兔血清RANKL水平高于去势组， 差异具有统计学意义（P<0.05）。结论 铁

蓄积状态可进一步上调去势骨质疏松大鼠血清TRAP-5b及RANKL的表达， 下调血清BALP的表达， 从而加强骨吸收、减弱骨生成， 导致骨质疏松加重。

【关键词】 铁蓄积;去势;骨质疏松;骨代谢

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2019.20.103

Influence of iron accumulation on biochemical indicators of bone metabolism in ovariectomized osteoporosis rabbits   KUANG Li-peng， TAN Wei-yuan， CHEN Jun-ping， et al. Department of Orthopaedics， Fifth Affiliated Hospital of Zunyi Medical University， Zhuhai 519100， China

【Abstract】 Objective   To discuss the influence of iron accumulation on biochemical indicators of bone metabolism in castration osteoporosis rabbits. Methods   A total of 30 8-month-old New Zealand rabbits were randomly divided into control group， castration group and iron accumulation castration group， with 10 rabbits in each group. Castration group and iron accumulation castration group received ovariectomy， and the iron accumulation castration group was injected with sucrose iron after ovariectomy. Bone mineral density （BMD） of lumbar spine and right femur and bone metabolic index of rabbits at different time after model establishment were compared among three groups. Results   At 20 weeks after modeling， iron accumulation castration group had obviously lower BMD of lumbar spine and right femur than control group and castration group， and castration group had obviously lower BMD of lumbar spine and right femur than control group. Their difference was statistically significant （P<0.05）. After 12 and 20 weeks of modeling， castration group and iron accumulation castration group had obviously higher serum tartrate-resistant acid phosphatase 5b （TRAP-5b） than control group， and lower serum bone alkaline phosphatase （BALP） than control group. Their difference was statistically significant （P<0.05）. Iron accumulation castration group had obviously higher serum TRAP-5b as （9.17±0.48） and （11.45±0.32） U/L than （7.04±0.40） and （8.56±0.17） U/L in castration group， and lower serum BALP as （18.87±1.72） and （15.16±0.72） U/L than （22.62±1.63） and （19.72±0.43） U/L in castration group. Their difference was statistically significant （P<0.05）. After 12 and 20 weeks of modeling， castration group and iron accumulation castration group had higher serum receptor-activator of nuclear factor κ B ligand （RANKL） than the control group， and iron accumulation castration group had higher serum RANKL than castration group. Their difference was statistically significant （P<0.05）. Conclusion   Iron accumulation can further up-regulate the expression of TRAP-5b and RANKL in serum and down-regulate the expression of BALP in serum of ovariectomized osteoporotic rats， thereby enhancing bone resorption and weakening bone formation， leading to the aggravation of osteoporosis.

【Key words】 Iron accumulation; Castration; Osteoporosis; Bone metabolism

绝经后骨质疏松症（postmenopausal osteoporosis， PMOP） 是指女性绝經后出现卵巢内分泌功能衰退， 雌激素水平下降， 从而导致骨量减少的一种代谢性疾病[1]。该病发病率较高[2]， 是老年女性胸腰椎骨折发病的主要原因[3]， 对老年女性的生活产生重大的影响[4]。有研究表明， 人体铁蓄积状态可能与绝经后女性骨密度（bone mineral density， BMD）降低密切相关[5]。本研究于2017年6月～2018年11月观察了铁蓄积对去势骨质疏松家兔骨代谢生化指标表达的影响， 现报告如下。

1 材料与方法

1. 1 材料来源 动物：30只8月龄新西兰大白兔， 雌性， 体重2.3～2.5 kg， 购自广东省医学实验动物中心， 许可证号：[SCXK（粤）2014-0035]。实验动物分笼饲养， 自由进食、饮水。饲养环境：温度20～25℃， 相对湿度为40%～70%。主要试剂：兔血清BALP 酶联免疫吸附剂试验（ELISA）试剂盒（武汉贝茵莱生物科技有限公司）、兔血清TRAP-5b ELISA试剂盒（武汉贝茵莱生物科技有限公司）、兔血清RANKL ELISA试剂盒（武汉贝茵莱生物科技有限公司）、蔗糖铁注射液（广东天普生化医药有限公司）。主要仪器：双能X线骨密度仪（OSTEOCORE， 法国MEDILINK）， 全波长酶标仪（Multiskan Go， 赛默飞世尔科技有限公司）。将30只雌性8月龄新西兰家兔随机分为对照组、去势组、铁蓄积去势组， 每组10只。

1. 2 兔铁蓄积状态骨质疏松模型的建立

1. 2. 1 卵巢切除术 去势组和铁蓄积去势组以10%水合氯醛按1.5 ml/kg剂量经耳缘静脉注射充分麻醉， 消毒、铺无菌巾， 于兔腹正中耻骨联合上方作一长约9 cm切口， 打开腹腔， 去势组和铁蓄积去势组切除双侧卵巢， 关闭腹腔缝合切口;对照组打开腹腔找到卵巢后即关闭腹腔缝合切口。术后3 d内肌内注射庆大霉素1万U/kg， 2次/d。术后各兔自由进食、饮水。

1. 2. 2 注射蔗糖铁 铁蓄积去势组于卵巢切除术后1周经耳缘静脉注射蔗糖铁， 剂量为15 mg/kg， 1次/周， 共12周建立兔铁蓄积状态骨质疏松模型， 同时对照组与去势组以相同频次经耳缘静脉注射等量生理盐水。

1. 3 观察指标 比较三组兔造模后不同时间腰椎、右股骨BMD及兔骨代谢指标水平。

1. 3. 1 兔骨代谢指标测定 三组兔分别于造模后4、12、20周经耳缘静脉取血5 ml， 置于离心机中， 5000 r/min 离心5 min， 收集血清。采用ELISA测定血清TRAP-5b、BALP、RANKL水平， 具体方法参见相应的试剂盒说明书。

1. 3. 2 兔腰椎及右股骨BMD检测 于造模后4、12、20周， 三组兔分别予10%水合氯醛按1.5 ml/kg剂量经耳缘静脉注射麻醉后， 俯卧位置于双能X线骨密度仪上， 将兔四足充分伸展， 采用双能X线骨密度仪小动物模式对各兔进行扫描， 检测各兔腰3～5椎及右侧股骨BMD情况。

1. 4 统计学方法 采用SPSS17.0统计学软件对研究数据进行统计分析。计量资料以均数 ± 标准差（ x-±s）表示， 组间两两比较采用LSD-t检验， 多组比较采用单因素方差分析。P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2. 1 造模后实验兔一般情况 三组兔术后3 d活动较少， 进食饮水量减少， 考虑与术后切口疼痛有关。三组兔于术后第4天均可正常饮食， 活动恢复正常。三组兔术后切口均愈合良好， 无红肿、皮温高等表现， 无兔出现死亡， 所有实验兔于术后1周拆除缝线。铁蓄积去势组各兔注射蔗糖铁后饮食二便、活动无异常， 无兔出现死亡。

2. 2 三组兔造模后不同时间腰椎及右股骨BMD比较 造模后4、12周， 三组兔腰椎及右股骨BMD比较差异无统计学意义（P>0.05）。造模后12周， 三组兔腰椎及右股骨BMD与本组造模后4周比较差异无统计学意义（P>0.05）。造模后20周， 去势组、铁蓄积去势组兔腰椎及右股骨BMD低于本组造模后12周， 差异具有统计学意义（P<0.05）。造模后20周， 铁蓄积去势组兔腰椎及右股骨BMD明显低于对照组及去势组， 去势组兔腰椎及右股骨BMD明显低于对照组， 差异有统计学意义（P<0.05）。见表1。

2. 3 三组兔造模后不同时间血清TRAP-5b、BALP水平比较 造模后4周， 三组兔血清TRAP-5b、BALP水平比较差异无统计学意义（P>0.05）;造模后12、20周， 去势组、铁蓄积去势组兔血清TRAP-5b水平明显高于对照组、血清BALP水平低于对照组， 铁蓄积去势组兔血清TRAP-5b水平明显高于去势组、血清BALP水平低于去势组， 差异有统计学意义（P<0.05）。见表2。

2. 4 三组兔造模后不同时间血清RANKL水平比较 造模后4周， 三组兔血清RANKL水平比较差异无统计学意义（P>0.05）;造模后12、20周， 去势组、铁蓄积去势组兔血清RANKL水平高于对照组， 铁蓄积去势组兔血清RANKL水平高于去势组， 差异具有统计学意义（P<0.05）。见表3。

3 讨论

PMOP是临床常见的骨质疏松[6]， 多发病于绝经后5～10年的老年女性[1]， 是老年女性易发生胸腰椎及腕部骨折的主要原因[2]。目前有研究指出， 女性在绝经后会出现铁蓄积状态， 这主要与绝经后女性体内转铁蛋白表达下降有关 [7]。而有研究表明， 体内铁蓄积状态与女性绝经后BMD下降有重要关联[8]。更有学者指出铁蓄积可能是骨质疏松发生的独立危险因素[9]。因此， 明确铁蓄积状态对绝经后骨质疏松BMD的影响， 可有望寻求有效的防治PMOP的疗法。

本研究采用去势联合注射蔗糖铁的方法成功建立兔铁蓄积去势骨质疏松模型， 从研究结果可得， 造模后4、12周， 三组兔腰椎及右股骨BMD比较差异无统计学意义（P>0.05）。造模后20周， 铁蓄积去势组兔腰椎及右股骨BMD明显低于对照组及去势组， 去势组兔腰椎及右股骨BMD明显低于对照组， 差异有统计学意义（P<0.05）。由此可推测， 铁蓄积可致去势骨质疏松家兔骨量丢失更为严重。但铁蓄积状态如何加重绝经后骨质疏松骨量的丢失， 目前其机制尚未完全明确[10]。

本实验从铁蓄积状态与骨代谢生化指标表达相关性入手， 尝试探讨铁蓄积状态加重绝经后骨质疏松的作用机制。

实验常用于检测的骨代谢生化指标较多， 如甲状旁腺激素（PTH）、TRAP-5b、BALP、Ⅰ型前胶原氨基端前肽（PINP）、RANKL等[11]。本研究在造模后4、12、20周检测三组兔血清骨代谢生化指标TRAP-5b、BALP、RANKL的表达， 从实验结果可得， 造模后12、20周， 去势组、铁蓄积去势组兔血清TRAP-5b水平明显高于对照组、血清BALP水平低于对照组， 铁蓄积去势组兔血清TRAP-5b水平明显高于去势组、血清BALP水平低于去势组， 差异有统计学意义（P<0.05）。

造模后12、20周， 去勢组、铁蓄积去势组兔血清RANKL水平高于对照组， 铁蓄积去势组兔血清RANKL水平高于去势组， 差异具有统计学意义（P<0.05）。说明自造模12周起， 去势组与铁蓄积去势组骨代谢生化指标表达与对照组比较有明显差异， 并随造模时间增长差异更为明显。而与去势组比较， 铁蓄积去势组兔血清BALP下降与RANKL、TRAP-5b上升最为显著。TRAP-5b与BALP分别为破骨细胞和成骨细胞分泌的蛋白[12]， 两者的表达水平分别反映骨吸收与骨形成的情况[13]。从实验结果可推测， 铁蓄积状态在绝经后骨质疏松基础上可能进一步下调BALP及上调TRAP-5b的表达， 从而减弱成骨细胞活性、加强破骨细胞活性， 从而促进骨吸收、减少骨生成， 导致骨量进一步丢失。

骨保护素（OPG）/核因子κ B受体活化因子（RANK）/RANKL系统在骨代谢调节的动态平衡中起重要作用[14]， 该系统多用于骨质疏松发病机制的研究[15]， 而RANKL是该系统重要的受体活化因子[16]， 主要调节破骨细胞的分化与成熟[17]， 对骨内稳态的调节起重要作用[18]。从实验结果可知， 铁蓄积去势组RANKL表达水平会较单纯去势组上升明显， 可推测铁蓄积可能在下调BALP及上调TRAP-5b表达的同时， 调RANKL的表达， 导致OPG/RANK/RANKL系统的动态平衡被打破， 促进破骨细胞分化成熟， 使骨吸收增加， 引起骨质疏松加重。

从研究结果可得， 在造模后12周起去势组与铁蓄积去势组兔骨代谢生化指标已出现明显改变， 而在造模后20周才出现BMD的改变， 骨代谢生化指标可早期反映铁蓄积去势组兔骨质情况， 对于早期防治绝经后骨质疏松有指导意义。

综上所述， 铁蓄积状态可进一步上调去势骨质疏松大鼠血清TRAP-5b及RANKL的表达， 下调血清BALP的表达， 从而加强骨吸收、减弱骨生成， 引起骨质疏松加重。

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[收稿日期：2019-02-26]