载竹红菌素纳米靶向探针的制备及其体外对NPC细胞寻靶能力的实验研究

王萍 岳文胜 唐雪梅 罗玉群 李祖坤

[摘要] 目的 制备一种可载竹红菌素（H）并具有叶酸（FA）分子靶向性的纳米级超声分子探针，探讨其基本特性及体外寻靶能力。 方法 按一定比例将H、聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）溶解于有机溶剂中，采用双乳化法制备载有H的纳米级超声造影剂（PLGA/H），观察测量PLGA/H的基本特性、包封率及载药量，并优化H的最佳剂量。通过添加偶联叶酸的磷脂DSPE-PEG（2000）Floate在PLGA表面连接FA分子后，采用双乳化法制备出既载有H，又具有FA分子靶向功能的納米微粒（PLGA-FA/H）。将PLGA/H和PLGA-FA/H分别作用于体外培养的人鼻咽癌（NPC）细胞株CNE2（FA受体高表达）和CNE2（FA受体低表达），观察并比较其靶向性。 结果 成功制备了载有H的纳米微粒PLGA/H，该纳米微粒的平均粒径为（220.50±91.37）nm，形态圆整，大小均匀且分散性好。PLGA-FA/H纳米微粒可与人NPC细胞株（FA受体高表达）的CNE2细胞靶向结合，而与NPC细胞株（FA受体低表达）的CNE2细胞靶向结合不明显。 结论 成功制备了一种可载有H且具有FA分子靶向功能的超声造影纳米微粒—PLGA-FA/H，其对人NPC细胞株（FA受体高表达）的CNE2细胞具有靶向性。

[关键词] 超声;纳米微粒;竹红菌素;叶酸;靶向

[中图分类号] R739.8          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2019）07（a）-0016-05

Experiment study of preparation of homomycin nanoparticle targeting probe and its ability to target NPC cells in vitro

WANG Ping   YUE Wensheng   TANG Xuenei   LUO Yuqun   LI Zukun

Department of Ultrasound， the Affiliated Hospital of North Sichuan Medical College， Sichuan Province， Nanchong   637000， China

[Abstract] Objective To prepare a nano-scale ultrasound molecular probe carrying hypocrellin （H） and targeting folic acid （FA） molecule， and to investigate its basic characteristics and in vitro targeting ability. Methods H and polylactic acid-glycolic acid （PLGA） were dissolved in organic solvents in a certain proportion. Nano-scale ultrasound contrast agent （PLGA/H） containing H was prepared by double emulsification method. The basic characteristics， entrapment efficiency and drug loading of PLGA/H were observed and measured， and the optimal dosage of H was optimized. After the FA molecule was attached to the surface of PLGA by adding folate-conjugated phospholipid DSPE-PEG （2000） Floate， nanoparticles with both H and FA molecular targeting function （PLGA-FA） were prepared by double emulsion method.  PLGA/H and PLGA-FA/H were respectively applied to human nasopharyngeal carcinoma （NPC） cell lines CNE2 （high expression of FA receptor） and CNE2 （low expression of FA receptor） in vitro to observe and compare their targeting. Results The nanoparticle PLGA/H carrying H was successfully prepared. The average particle size of the nanoparticles was （220.50±91.37） nm， the shape was round， the size was uniform and the dispersion was good. PLGA-FA/H nanoparticles can be targeted to CNE2 cells （high expression of FA receptor） of human NPC cell line， while CNE2 cells （low expression of FA receptor） with NPC cell line have no targeted binding. Conclusion PLGA-FA/H， a kind of contrast-enhanced ultrasound nanoparticle with H and FA molecular targeting function， has been successfully prepared， and it can target CNE2 cells （high expression of FA receptor） of human NPC cell line.

[Key words] Ultrasound; Nanoparticle; Hypocrellin; Folic acid; Targeted

起源于鼻咽部最常见的癌症是鼻咽癌，其在中国南方和东南亚发病率较高[1-2]。放射治疗目前是早期鼻咽癌的首选治疗方法，大多数鼻咽癌是低分化的癌症，对辐射的敏感性很高，而且放射治疗领域很容易包括原发和颈部淋巴引流区。复发性或转移性鼻咽癌的临床治疗比原发性鼻咽癌更为困难。这些患者的常规治疗是基于铂的化疗，其平均无进展生存时间为7个月[3]。因此，对于复发或转移性鼻咽癌患者，迫切需要确定一种更有效的治疗方案。分子靶向超声造影研究是近年来有关肿瘤的新兴技术研究，该研究已在肿瘤、心肌缺血及周围血管疾病等方面显示出明确的诊断价值，而叶酸（folic acid，FA）受体因在鼻咽癌中高表达[4]而成为研究的重点之一。本研究以可载有竹红菌素（H）且具有FA分子靶向功能的超声造影纳米微粒为目的，观察该纳米微粒的基本特性及体外寻靶能力，为进一步进行动物体内的超声造影研究奠定基础。

1 主要试剂及设备

竹红菌素（中国科学院化学研究所提供），聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA，LA∶GA=50∶50，分子量为10 000，赢创-德固赛公司，批号：2018101508），FA和聚乙烯醇（PVA）（Sigma，美国，货号：JP1763）。SONICS超声声振仪、ZNCL-BS智能数显磁力搅拌器、高速离心机、UV-2600紫外分光光度仪、激光粒徑测量仪、扫描电镜和、透射电镜。

2 方法与结果

2.1 载H的纳米微粒的制备及优化

本研究采用双乳化法制备纳米微粒：①取50 mg PLGA溶于5 mL二氯甲烷。②H母液用二甲基亚砜（DMSO）溶解成浓度为100 mmol/L母液，再用去离子水中，配制成终浓度为2.5 mmol/L的储存液，将其加入到溶有PLGA的二氯甲烷溶液中;③采用超声制备初乳（功率为200 W），采用2s-2s-3个水平的初乳乳化次数，获取白色乳化液（初乳，W/O微粒），将初乳转移到5% PVA水溶液中，按上述超声条件（2s-2s-3次），再次采用超声制备复乳W/O/W微粒），搅拌去除可挥发的有机溶剂，冻干备用;④双蒸水高速离心洗涤后收集PLGA/H纳米微粒。通过添加偶联叶酸的磷脂DSPE-PEG（2000）Floate在PLGA表面桥接FA分子，采用上述相同的方法制备PLGA-FA/H，将制备的PLGA/H和PLGA-FA/H纳米微粒置于4℃冰箱保存。将制成的纳米微泡与普通Sonovue超声造影微泡进行比较研究。

2.2 PLGA/H包封率和载药量的测定

实验根据H的含量共分为四组，即空白组、2 mg H组、4 mg H组、8 mg H组。取新制备的PLGA/H纳米溶液1 mL，分别溶于1 mL DMSO中，将溶解的悬液离心，取上清液，加入氢氧化钠溶液（pH=12）0.5 mL溶解，再加入二氯甲烷涡旋5 min，二次离心后取上清液，采用Zetasizer Nano ZS90激光粒径测量仪测定纳米溶液的粒径，高效液相色谱法检测PLGA/H纳米微粒的包封率及载药量，检测波长为283 nm，实验重复操作3次。计算公式：

载药量=H的质量/纳米粒的总质量×100%

2.3 纳米微粒的体外寻靶实验

将人鼻咽癌细胞株CNE2（FA受体高表达）和CNE2（FA受体低表达）在置于无FA的RPMI1640细胞培养基中，37℃、5% CO2常规细胞培养、传代。选取对数生长期的CNE2（FA受体高表达）和CNE2（FA受体低表达）细胞，按照1×107/mL种瓶，1×104/mL种于6孔板中，并进行细胞培养，孵育4 h后，弃培养液后，用磷酸缓冲盐溶液（PBS）洗涤2次。加入纳米微粒后，实验分为4组：CEN2细胞（FA受体高表达）+PLGA/H组、CNE2（FA受体低表达）+PLGA/H组、CEN2细胞（FA受体高表达）+PLGA-FA/H组、CNE2（FA受体低表达）+PLGA-FA/H组。每孔追加2 mL 10%无FA的RPMI1640细胞培养基后继续培养30 min，采用PBS缓冲液反复冲洗3次，在光镜下观察纳米微粒与各组细胞的结合情况。

2.4 统计学方法

采用SPSS 16.0统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验;纳米微粒结合细胞数计数用线性回归分析，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2.5 结果

2.5.1 PLGA/H纳米微粒的粒径和形态观察  PLGA/H纳米微粒的平均粒径为（220.50±91.37）nm，粒径分布系数（PDI）为0.184，呈单峰分布，而Sonovue的平均粒径为（1702.50±164.30）nm[7]，两者粒径大小差异有统计学意义（P < 0.05）。纳米微粒呈球形、大小均匀，微粒间无黏连。见图1～2。

2.5.2 PLGA/H纳米微粒包封率和载药量的测定  实验检测结果表明，8 mg H组的PLGA/H包封率及载药量最高，因此选择8 mg H作为制备PLGA/H纳米微粒的最佳剂量。见表1。

2.5.3 各组纳米微粒体外寻靶实验结果  PLGA-FA/H组可见较多纳米粒结合在CNE2（FA受体高表达）周围，并部分进入细胞内，而其他组均未见明显的纳米微粒与CNE2细胞靶向结合的现象。见图3。PLGA-FA/H纳米微粒结合细胞数计数分析结果显示，结合于细胞表面的纳米粒会随着细胞数量的增加而增加，两者呈正相关：Y=0.098X+0.07（R2 = 0.95，P < 0.05）。见图4。

A：CNE2细胞（FA受体低表达）+PLGA/H组;B：CNE2细胞（FA受体高表达）+PLGA/H组;C：CNE2细胞（FA受体低表达）+PLGA-FA/H组;D：CNE2细胞（FA受体高表达）+PLGA-FA/H组。箭头所示为CNE2细胞（FA受体高表达）与PLGA-FA/H纳米微粒结合并可见其进入细胞体内。PLGA：聚乳酸-羟基乙酸共聚物;H：竹红菌素

3 讨论

新型超声造影技术是在以声诺维为代表的氟碳声学超声造影剂及新的超声造影成像模式基础上发展起来的新兴技术。该技术受到医学各学科领域的关注，已在肿瘤、心肌缺血及周围血管疾病等方面显示出明确的诊断价值，并已进入临床研究。超声造影剂不仅是一种良好的器官显影剂，而且能作为一种重要的药物传输载体[5-9]。应用超声仪器的动态探查，可以直观地观察到载药微泡经静脉、淋巴管等传输途径迅速聚集于肿瘤靶器官的内部及周围组织情况。小粒径的纳米造影剂较微米级的造影剂有更强的组织穿透能力，为超声造影在特异性诊断领域中开辟了崭新的研究领域，为新型超声造影剂的研制开辟了新的研究方向。因此，以脂质壳膜包裹H为基础，研制一种穿透力强的纳米级声敏性声学造影剂，将为鼻咽癌尤其是复发性或转移性的鼻咽癌治疗提供新的思路和新手段。

H是一种中草药光敏剂，单纯的H对细胞没有细胞毒性作用，前期工作发现低强度超声活化竹红菌素B介导的声动力作用后，对鼻咽癌细胞CNE2有明显的杀伤作用。基于这一发现而兴起的H纳米声学造影剂的靶向鼻咽癌治疗技术为解决上述困难带来了希望[10]。国内外研究学者[4]证明人鼻咽癌细胞表面存在高表达的FA受体（阳性率达85%，其中近50%为高表达），而临床晚期病人的FA表达阳性率更高，故本实验研究选择FA受体作为鼻咽癌细胞上的靶点，希望通过制作一种带可载竹红菌素H的纳米级超声微泡靶向连接于鼻咽癌细胞的FA受体上，从而在后期的實验中达到对鼻咽癌细胞的治疗作用。

既往微米级超声靶向微泡直径大于血管内皮间隙（380～780 nm），因此微米级的载药微粒无法透过血管达到血管外肿瘤所在区域。而且大多数针对靶向微泡的治疗作用是关于其被动靶向治疗作用的研究，即载药微粒达到肿瘤区域时，外在加以超声辐照、电荷或化学等特性，使载药微泡破裂并释放所载药物，作用于指定肿瘤组织，这种方法在一定程度上具有靶向作用[11]。

而纳米微粒经具有稳定性好、不易变形、在血流的剪切力的冲击冲击下不易破裂等优点;尤其是其体积小能透过血管内皮间隙到达血管外组织内，有效避免在体内产生免疫原性，不被网状内皮系统吞噬，延长其在体内的半衰期。如今大量的纳米级靶向微粒的研究使得载药纳米微粒可以实现血管外肿瘤细胞的分子显像及主动靶向治疗作用，所谓主动靶向治疗是指利用纳米粒表面能连接可以特异表达的抗原、抗体或配体，产生特异识别肿瘤细胞的原理，可以制成各种针对肿瘤细胞表达的特异纳米微粒，比如肿瘤细胞表面高表达的FA、低密度脂蛋白、转铁蛋白等[12-19];或者采用亲和素-生物素法将纳米粒与肿瘤靶细胞特异结合，比如纳米微泡-Affibody微粒的构建，在体外能特异靶向各种HER2（+）肿瘤细胞[20-21]。本研究制备的PLGA-FA/H纳米微粒能特异的识别肿瘤细胞鼻咽癌表面的FA受体并成功进入细胞体内，达到主动靶向的作用。

本研究通过筛选H的剂量，采用双乳化法成功制备纳米微粒PLGA/H，该纳米微粒呈球形，大小均匀，分散性良好;通过添加偶联叶酸的磷脂DSPE-PEG（2000）Floate在PLGA表面连接FA分子后成功制备了具有FA分子靶向功能的纳米微粒PLGA-FA/H，为后期动物实验研究奠定了实验基础。

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