自酿原浆啤酒氨基酸态氮含量和总酸的测定

米 智，刘荔贞，武晓红，骈亚男

（1.山西大同大学生命科学学院，山西大同 037009；2.山西大同大学化学与环境工程学院，山西大同 037009）

啤酒是以大麦芽为主要原料，添加颗粒酒花，经酵母菌发酵酿制而成的含二氧化碳、起泡、低酒精浓度的饮料酒。啤酒作为一种低酒精度的麦芽饮品，因其具有良好的风味、丰富的营养及良好的口感而颇受消费者喜爱。

啤酒是全球消费人数最多、分布国家最广、产销量最大的酒种。因其具备特有的“色香味”，故风味物质是其质量的重要组成部分。啤酒风味主要包括闻到的香气（aroma）、尝到的口味（taste）及感觉到的口感（mouthfeel）[1]。香气、口味是由一种或几种风味化学物质刺激嗅觉传感器或味觉传感器产生。口感是啤酒与口腔、牙齿、牙龈等的接触感觉，由触觉传感器产生，受物质本身及物质间交互作用的影响，是啤酒的一种综合感觉[2]。已经证明，适度饮用啤酒，至少与喝葡萄酒效果相同，可降低冠心病、心脏病的发病率，降低糖尿病的死亡率等[3-4]。

化学成分是风味形成的物质基础，同时决定了啤酒的质量和风格特色。啤酒中的风味物质有数千种之多，主要包括醇类、酯类、有机酸类、酮类、醛类、呋喃类（麦芽香）、吡嗪类（麦芽香）、烯类（颗粒酒花香）、氨基酸、二甲基硫醚（DMS）和二氧化硫等[5]。它们之间微妙的平衡关系，共同构成啤酒的特有风格。啤酒的苦味主要源自酒花树脂，极少部分来自酿造过程的苦味肽、氨基酸、多酚等非颗粒酒花成分[6-7]。啤酒的风味和香气也受到二氧化碳压力的影响[8-9]。有文献报道，啤酒中所有风味活性成分都是由酵母产生的，这些化合物决定啤酒的最终质量[10]。啤酒中含有各种酸类200 种以上，这些酸及其盐类控制着啤酒的pH 值和总酸的含量[11]。就口感而言，酸类物质是啤酒的主要风味成分之一。总酸适度的啤酒口感清爽；酸含量太低时啤酒口感粗糙、不爽；总酸偏高,口味单调，入口有不愉快的感觉[12]。啤酒的氨基酸态氮是用来反映其中的氨基酸及小肽总体水平的重要指标，其含量的高低也影响酒的质量等级和整体风味[13]。所以，啤酒总酸和氨基酸态氮的检验和控制是十分重要的。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

酒样：山西大同大学生物工程试验中心酿造原浆啤酒，市售常见啤酒（易拉罐装雪花、哈尔滨和纯生啤酒）。

菌种及原料：啤酒活性干酵母s-23（弗曼迪斯酵母有限公司），大麦芽（山东济南豪鲁机械设备有限公司），颗粒酒花（美国Cascade，威海德科生物科技有限公司）。

试剂：氢氧化钠（AR，上海源叶生物科技有限公司）、甲醛（天津市福晨化学试剂厂）、酚酞（无锡市亚泰联合化工有限公司）、pH6.86、pH 9.18 标准缓冲液（成都方舟科技有限公司）。

仪器设备：山西大同大学生物工程试验中心100 L 原浆啤酒生产线，糖度计，精密电子天平、恒温水浴锅、碱式滴定管、pHS-3C 酸度计，成都世纪方舟科技有限公司；电磁炉（苏泊尔）、HH-6数显恒温水浴锅，常州市金坛友联仪器研究所；85-2 数显恒温磁力搅拌器，常州市金坛良友仪器有限公司等。

1.2 试验方法

1.2.1 自酿原浆啤酒生产工艺（图1）

图1 自酿原浆啤酒生产工艺流程图

（1）大麦原料的选择。大麦芽一般含有淀粉、半纤维素和麦胶物质、蛋白质和多酚物质，而蛋白质含量高低和类型，直接影响制麦芽醪和酿造工艺及啤酒的质量。一般宜选用蛋白质含量低、色度和黏度较低的大麦芽原料。

（2）大麦芽的粉碎。由于大麦芽具有谷皮，粉碎可适当细些，有较大的比表面积，使物料中储藏物质增加和水、酶的接触面积，加速酶促反应及物料的溶解。大麦芽粉碎时应做到皮壳破而不碎，以提高过滤效率，故要尽量使用湿法粉碎或增湿粉碎，以保持大麦芽种皮和果皮的完整性。所谓湿法粉碎，是将麦芽用20～50 ℃的温水浸泡15～20 min，使麦芽含水量达25%～30%之后，再用湿式粉碎机粉碎，之后兑入30～40 ℃的水调浆，泵入糖化锅。大麦芽粉碎时，谷皮25%～30%，粗粒8%～12%，细粒30%～35%，细粉20%～25%。

（3）糖化。糖化主要指麦芽和辅料中高分子贮藏物质及其分解产物，通过麦芽中各种水解酶类作用，以及水和热力作用，使之分解并溶解于水。主要考虑淀粉等糖类和蛋白质的分解。淀粉糖化时，主要有α-淀粉酶、β-淀粉酶、异淀粉酶和葡萄糖酶4 种，综合4 种酶的最适温度和最适pH 值，投料温度为50～55 ℃，70 min，pH 值为5～6 之间；随后升温至60～65 ℃，70 min，pH 值为5～6 之间。最后用碘液试醪液不呈色来鉴别。

麦芽蛋白水解最终产物——氨基酸是合成啤酒酵母含氮物质的主要来源。麦汁中可溶性氮及其分解中间产物——肽类是啤酒风味和泡持性的重要物质，它们赋予啤酒醇厚丰满的口感。在糖化工程中蛋白质分解主要依靠麦芽的蛋白酶和羧肽酶催化水解，其次是氨肽酶和二肽酶，它们的作用温度是40～65 ℃，蛋白质休止分阶段进行，增加63 ℃温度段，并适当延长休止时间。

其糖化工艺如下：

50 ℃投料，保温30 min→55 ℃保温70 min→65 ℃保温80 min→72 ℃直至碘检合格为止→75 ℃麦汁过滤。糖化各阶段的升温应按1 ℃/min 进行控制。

（4）过滤。麦芽醪过滤之后剩下的麦糟，应该用75 ℃水洗糟1～2次，每次20～30 min，中间开耕刀搅拌1次，以求最大化得到糖度高的醪液。

（5）麦汁煮沸。麦汁煮沸阶段，应提高煮沸强度，延长煮沸时间。如采用外加热煮沸，在108～110 ℃的温度下，只需煮沸60～80 min。颗粒酒花中的主要成分有树脂、颗粒酒花油、多酚等，这些成分在煮沸过程中的氧化、聚合和异构化，对啤酒有极为重要的意义。颗粒酒花添加量是热麦汁量的0.1%，分两次添加颗粒酒花，第一次在初沸10 min时，添加量为颗粒酒花总量的一半（苦花），第二次煮沸70 min，添加量为颗粒酒花总量的另一半（香花），麦汁煮沸过程中，由于类黑素的形成以及多酚物质的氧化使麦汁的色度不断上升。

（6）麦汁处理。大麦芽麦汁有较多的热、冷凝固物，需分离，不仅有利于酵母发酵，而且有利于提高啤酒的非生物稳定性。还需冷却、充氧等一系列处理，才能制成发酵麦芽醪。

（7）发酵。利用实验室现有发酵罐的设备，按照现行工艺，每天检测麦芽醪的糖度，最初麦芽醪入发酵罐时的糖度为11 单位，当糖度下降至4.2～4.5 时，可以封罐。封罐4～6 d 后，温度降至8.0～8.5 ℃，之后每天要检测双乙酰的还原量，并适度降温。到达0 ℃及其以下之后，每天排渣一次，以防止酵母自溶。啤酒冷贮的温度和时间对啤酒的冷稳定性影响较大。啤酒的冷贮温度为-1～0 ℃，冷贮时间至少在7 d 以上，同时在贮酒过程中温度不得回升。

1.2.2 氨基酸态氮的测定

啤酒发酵过程大约半个月时间，故本试验从麦芽醪进发酵罐第1 天开始，到发酵第15 天结束，每天同一时间点取啤酒样本，同一时间点做对应的实验，保证发酵时间尽可能相同，做平行实验3 次，记录数据，Excel分析数据。

由于氨基酸是两性化合物，不能直接用氢氧化钠溶液滴定，需要先加入甲醛使氨基的碱性被掩蔽后，呈现羧基酸性，才能对酒样以氢氧化钠溶液滴定。

氨基酸态氮含量测定方法以食品安全国家标准GB 5009.235—2016中的酸度计法（甲醛值法）[14]。具体步骤如下：

（1）准确量取5 mL 待测啤酒移入100 mL 的容量瓶中定容。

（2）从容量瓶中吸取10 mL 稀释后的啤酒待测样品移入100 mL 烧杯中，加水30 mL，打开磁力搅拌器使其搅拌混匀。

（3）用0.05 mol/L 的NaOH 标准滴定溶液滴定至酸度计指示pH8.2，记录消耗NaOH的体积。

（4）在上述试样中加入10 mL 准备好的甲醛溶液，摇匀。再用NaOH 标准滴定溶液继续滴定至pH9.2，记录消耗NaOH的体积。

（5）同时取80 mL 水，先用0.05 mol/L 的NaOH标准滴定溶液滴定至溶液pH8.2，再加入10 mL 甲醛溶液，继续用NaOH 标准滴定溶液滴定至pH9.2，做试剂空白试验。实验重复3 次，求平均值，求标准差。

式中：X——试样中氨基酸态氮的含量，g/100 mL；

V1——测定用试样稀释液加入甲醛后消耗氢氧化钠标准滴定溶液的体积，mL；

V2——试剂空白实验加入甲醛后消耗氢氧化钠标准滴定溶液的体积，mL；

c——氢氧化钠标准滴定溶液的浓度，mol/mL；

0.014——与1.00 mL 氢氧化钠标准滴定溶液[c(NaOH)=1.000 mol/L]相当的氮的质量，g；

V——吸取试样的体积，mL；

V3——试样稀释液的取用量，mL；

V4——试样稀释液的定容体积，mL；

100——单位换算系数。

1.2.3 总酸的测定

利用酸碱中和原理，用NaOH 标准溶液直接滴定啤酒试样中的总酸，以pH8.2 为电位滴定终点，根据消耗NaOH 溶液的体积计算出啤酒总酸的含量[15]。

酸度计的校正：按要求连接玻璃电极和饱和甘汞电极。取下甘汞电极胶帽，加液孔胶塞和下端胶帽，用pH6.68和pH9.18(25 ℃)标准缓冲溶液校正酸度计。

样品的处理：取待测啤酒样本约100 mL 于250 mL 烧杯中，置于40 ℃±0.5 ℃振荡水浴中恒温30 min，取出，冷却至室温。

样品的测量：用水清洗电极，并用滤纸吸干附着电极的液珠。吸取啤酒样品50 mL 于烧杯中，插入电极，开启电磁搅拌器，用氢氧化钠标准溶液滴定至pH8.2 即为终点。记录所消耗氢氧化钠的体积。

结果计算：试样的总酸含量即：100 mL 试样消耗NaOH 标准滴定溶液[c（NaOH）=1.0 mol/L]的毫升数，公式如下：

式中：X——样品的总酸含量，mL/100 mL；

C——氢氧化钠标准滴定溶液的浓度，mol/100 mL；

V——滴定所消耗氢氧化钠溶液的体积，mL；

2——换算成100 mL样品的系数。

2 结果与分析

2.1 氨基酸态氮含量

2.1.1 自酿原浆啤酒发酵过程中氨基酸态氮含量（图2）

图2 麦芽醪连续发酵15 d氨基酸态氮含量变化

从图2 可以得到，麦芽醪进入发酵罐连续发酵15 d 氨基酸态氮含量的变化趋势，前7 d 呈先升高后降低的变化趋势，在第4 天出现了极大值，约0.0115 g/100 mL，第1 天的氨基酸态氮含量是个极低值，约为0.0054 g/100 mL。在第2 周的时间里，氨基酸态氮在0.008 g/100 mL 上下波动，而且在第14 天出现了极大值，约0.0116 g/100 mL，在将近出酒时，氨基酸态氮含量最高，约为0.0142 g/100 mL，是15 d发酵过程中的最大值。

2.1.2 原浆成品啤酒与市售啤酒氨基酸态氮含量比较（图3）

图3 原浆成品啤酒与市售啤酒氨基酸态氮含量比较

通过测定自酿原浆成品啤酒与3 种常见市售啤酒的氨基酸态氮的含量，发现原浆成品啤酒、纯生和哈尔滨啤酒的氨基酸态氮含量几乎相当，而燕京啤酒的氨基酸态氮含量是测定啤酒中含量最高，约为0.0115 g/100 mL。啤酒蛋白质或含氮物质会很大程度地影响啤酒泡沫的质量[16-17]。蛋白质分解产物中总有氨基酸和多肽，而多肽物质的存在是形成悬浮物和沉淀物的前驱物质。因此蛋白质含量的多少直接影响到啤酒的质量[18-19]。

2.2 总酸

2.2.1 自酿原浆啤酒发酵过程中pH 值和总酸值(图4)

从图4 可以得到，麦芽醪在发酵的第1 天pH 值最高，约为5.4，第2 天酸性增强约为3.5，第3 天pH值约为4.8，而在随后的12 d 时间里，pH 值一直保持在4.2 左右，比较恒定。而测定的总酸变化规律，几乎同pH 值变化一致，但第3 天的总酸值是整个发酵阶段的最大值，约为1.68 mL/100 mL，远高于醪液中第2天酸性最强时的总酸。

2.2.2 原浆成品啤酒与市售啤酒pH 值与总酸的比较（图5）

图4 麦芽醪连续发酵15 d的pH值和总酸变化

图5 原浆成品啤酒与市售啤酒pH值和总酸的比较

通过测定自酿原浆成品啤酒与3 种常见市售啤酒的pH 值和总酸，发现原浆成品啤酒的pH 值最大，约为4.2，而其他市售常见啤酒的pH 值十分接近，约3.75。但是测定总酸的时候发现，与pH 值没有相关性，原浆成品啤酒的最高，其次是燕京啤酒的总酸值，而纯生和哈尔滨啤酒的总酸相当，是所测啤酒中最低。

3 讨论

氨基酸态氮指的是以氨基酸形式存在的氮元素的含量。氨基酸态氮是判定发酵产品发酵程度的特性指标。从整个发酵过程来看，氨基酸态氮含量呈波动性变化，但是在发酵的第3、第4 天和将近出酒的时候（14 d、15 d）含量最高，可能是在啤酒发酵初期，接种的啤酒酵母通过吸收麦汁中的含氮化合物，用于合成酵母菌细胞蛋白质、核酸和其他含氮化合物，繁殖细胞。活的啤酒酵母只能分泌很少的蛋白酶，因此，酵母菌只能从麦汁中吸收氨基酸、二肽、三肽等低肽氮化合物。故发酵前期（1 d、2 d）麦芽汁中的氨基酸态氮含量不高。啤酒酵母吸收氨基酸不是简单的浓度差扩散作用，而是依赖于细胞壁分泌一系列的氨基酸输送酶调节吸收，因此，发酵初期酵母必须合成一系列的氨基酸，由葡萄糖通过EMP 途径形成酮酸，酮酸接受-NH2构成早期不能合成的氨基酸，当然也有些氨基酸经转氨酶脱下-NH2，故麦芽醪当中的氨基酸态氮呈波动变化。麦芽醪中的氨基酸态氮还与啤酒生产工艺相关，比如麦芽醪煮沸中蛋白质的分解，糖化过程中蛋白质的分解，麦芽醪的温度、pH 值会影响酶的活性，也会影响蛋白的分解，以及麦芽醪的浓度也会影响[20]。当原浆啤酒发酵结束出酒的时候，我们发现其氨基酸态氮和常见市售啤酒的含量相当，故我们整个发酵工艺就氨基酸态氮含量方面，几乎符合市场要求。

啤酒中总酸的来源主要是麦芽等原料，糖化发酵的生化反应和化学反应、水及工艺调节外加酸[21]。从总酸测定图可以看到，发酵前3 天的变化比较大，大约在1.08 mL/100 mL 到1.68 mL/100 mL 之间，随后的12 d 内，一直处于1.02 mL/100 mL 小幅度波动，基本很稳定。前期的总酸来源是麦芽的原始总酸和糖化反应。

麦芽中的酶酸解，主要是植酸钙镁盐（菲汀），在麦芽煮沸过程中被磷酸酯酶降解，生成酸性物质[22-24]。还有甘油酸酶、淀粉磷酸酶和蛋白水解酶，以及糖类有氧呼吸过程的酸类物质等，但可以看到，麦芽汁中的酸性物质是磷酸性盐组成的缓冲液，故在发酵的中后期，总酸含量趋近一个稳定值。发酵过程中也会产生酸，比如：丙酮酸、α-酮戊二酸、乳酸、苹果酸、琥珀酸、脂肪酸等。发酵后期，醪液中会通过丙酮酸进行的歧化反应，形成乙酸和乳酸。通过与常见市售啤酒中的总酸比较发现，自酿原浆成品啤酒中的总酸略高一点，可能与生产工艺或酵母菌有关，但仍然符合国家标准（小于2.6 mL/100 mL）。

无酸不成酒，啤酒的香味虽然不是来源于酸类物质，但酸类物质对啤酒的味道有很大的影响。啤酒中含有适量的可滴定总酸，能赋予啤酒以柔和清爽、愉快的口感，当酸类物质较少时，口感单一、较寡淡；但总酸过高(大于2.6 mL/100 mL)或嗅之有明显的酸味(挥发性的乙酸等过高)的啤酒又是不被认可的[25]。

啤酒中氮元素含量不能过高也不能过低。若过高时，会有强烈的浓醇感；过低时，不具备啤酒应有的香味。只有在适合的范围内人们才能体验到啤酒独特的清爽感，口腔中还会有绵延不绝的湿润感。