血清基质金属蛋白酶-3检测试剂盒用于MODULAR P800型全自动生化分析仪中的性能评价

邓玲艳 岳道远 李辉军*

基质金属蛋白酶是一组锌离子依赖性的蛋白水解酶家族,是细胞外基质(extracellular matrix,ECM)降解及重构的重要介质,在人类至少25种已被识别和定性,其中以基质金属蛋白酶-3(matrix metalloproteinase-3,MMP-3)最为重要[1-3].MMP-3主要产生于滑膜细胞和软骨细胞,其特异性基质是构成软骨的蛋白多糖,已有许多文献报道MMP-3与类风湿关节炎(RA)的发生、发展及预后密切相关[4-9].

目前,基于全自动生化分析仪器的MMP-3定量检测试剂盒可应用于临床检测.2006年原国家卫生部颁布的《医疗机构临床实验室管理办法》中明确要求,临床实验室在某一检测项目正式用来检测患者标本、发出检验报告前,实验室需对其相关方法学分析性能进行评价.为此,本研究根据文献和国内外标准和指南的要求,评价积水公司的MMP-3定量检测试剂盒在实验室使用MODULAR P800型全自动生化分析系统的性能.

1 资料与方法

1.1 标本来源

采集2016年1-10月间华中科技大学同济医学院附属同济医院的130名表观健康体检者血清标本,其中男性和女性各65名.

1.2 仪器与试剂

罗氏MODULAR P800型全自动生化分析仪(瑞士Roche公司);MMP-3定量检测试剂盒及配套校准品、质控品(日本积水公司);干扰物A-PLUS(日本SYSMEX公司).

1.3 实验方法

全自动生化分析仪在性能评价前均按制造商要求经过功能校准,各项性能指标符合仪器厂商申明的性能要求,每日按指定的标准化操作程序进行维护保养和操作.实验人员均经过相应的培训,熟悉仪器的操作和整个性能评价实验方案.在性能评价期间,室内质控品检测结果合格后再进行各项实验.

1.4 验证与评价方案

1.4.1 精密度评价

参照美国临床实验室标准化研究所协会(clinical and laboratory standards institute,CLSI)EP5-A2标准[10]选取低值和高值2个浓度的质控品(批号MJ0251),标示浓度分别为(30±5)ng/ml和(160±25)ng/ml,按标本检测程序先在1 d内连续测定20次,然后每日测定1次,连续20 d,分别计算日内和日间均值、标准差和变异系数.将结果与试剂说明书不精密度数据进行比较,如果日内和日间不精密度均小于厂商数据指标,则精密度验证通过.

1.4.2 准确度评价

由于目前国内MMP-3尚无公认的有证参考物质,也无室间控制品来评估准确度.因此,参照CLSI EP15-A2标准[11]和毕波等[12]的报道,采用复测不同批号校准品计算偏差的方式进行准确度验证实验.即采用批号为815RLM(EXP:2016年10月)的校准品校准检测系统后,对另一批号为816RBN(EXP:2017年1月)的校准品进行检测,计算检测结果与标示值的偏差,并与实验室规定的允许偏差进行比较,如果偏差小于实验室的允许偏差,则该项目准确度符合要求.检测项目的允许偏差可来源于CLIA'88、基于生物学变异的技术规范、专业指南等文件,如果上述文件中都未规定该检测项目的允许偏差,可基于该项目当前所能达到的技术性能[13].

1.4.3 测量范围评价

参照CLSI EP6-A2标准[14]在试剂说明书的线性范围两端选取低浓度和高浓度两个标本各1份,命名为低浓度标本(L)和高浓度标本(H),然后将L和H按照5 L、4 L+H、3 L+ 2 H、2 L+3 H、1 L+4 H和5 H配成6个浓度的系列标本.每个标本重复检测2次,记录结果并计算线性回归方程和相关性系数r2,若r2>0.995,则表明线性关系良好,可接受厂商的分析测量范围.通过用低浓度标本稀释检测结果高于分析测量范围标本的方式,配制成合适浓度的标本用于评价实验.通常,配制好的高值标本应高于分析测量范围上限的90%.

1.4.4 检出能力评价

对于非配套检测系统,应根据CLSI EP17-A2指南[15]的要求来确立其检出能力,包括空白检出限(LoB)、检出限(LoD)和定量检出限(LoQ)等相关参数.选择制造商给出的测量范围下限10 ng/ml作为其LoQ进行验证.根据CLSI EP17-A2指南,选择仅基于不精密度目标的LoQ验证方式,采用CLSIEP15-A2不精密度验证指南,选取接近LoQ浓度的2个低值标本,用标记浓度为0的校准品对标本进行稀释至LoQ附近;对这2个标本进行连续4 d检测,每日重复测定5次,总计获得20个有效数据计算不精密度,所有检测在一个试剂批号内完成,如果有离群数据需删除后补足.若20个标本检测数据的不精密度小于制造商指标,LoQ验证通过.

1.4.5 临床可报告范围评价

临床可报告范围是指患者标本经稀释、浓缩或其他处理后,向临床所能报告的结果范围.选取高值标本3份,应有1份标本浓度接近分析测量范围上限1600 ng/ml(至少应高于分析测量范围上限的90%).将样本通过建议的5倍稀释倍数通过仪器自动以生理盐水稀释后检测2次取均值,将均值乘以稀释倍数来计算回收率,回收率为90%~110%,则验证稀释可靠,可以将线性范围上限乘以稀释倍数直接作为该项目的临床可报告范围的上限.

1.4.6 生物参考区间验证评价

参照国家行业标准《临床实验室检验项目参考区间的制定》(WS/T402-2012)[16]分别选择成年表观健康体检者男性、女性各65名,除了风湿、类风湿性关节炎、骨质疏松、肝肾功能、血糖、血脂、血常规、血沉及C反应蛋白(C-reactive protein,CRP)等检测指标以外均正常;相对较大样本数量来对试剂盒说明书中的生物参考区间进行验证,验证结果应该具有较大的参考价值.若≤5%的结果超出声明的参考区间,则验证通过,可以采用说明书中的生物参考区间.

1.4.7 分析干扰能力评价

(1)分析干扰能力.分析干扰是影响检测方法准确性的关键因素,要准确识别和评价临床检测中各种干扰因素对测定结果的影响相当困难,一般对于配套检测系统,可以直接引用制造商的抗干扰能力声明,但对于非配套检测系统,应对常见的干扰因素如胆红素、血红蛋白及乳糜颗粒对测定结果的干扰进行初步评价.本实验室依据CLSI EP7-A2指南[17]的建议,采用添加外源性干扰物的方式来进行MMP-3抗干扰性能的评估,购买日本Sysmex公司A PLUS系列干扰物,标示浓度分别是胆红素F 20 mg/dl(游离型),胆红素C 20 mg/dl(结合型),溶血血红蛋白50 mg/dl,乳糜2000 FTU(福尔马肼浊度)的干扰物和对应的空白液.将溶解好的干扰物和空白液分别与相同的标本按比例混合,制成不同稀释比例的标本进行检测,判断其受干扰的程度.

(2)操作方法.①将试剂盒中的干扰物和对照空白液分别按要求用纯化水溶解好备用;②将溶解好的干扰物1.0 ml与9.0 ml基础标本混合制成标本A,将溶解后的空白液1.0 ml与同样的9.0 ml基础标本混合制成标本B,标本A为干扰标本,标本B为对照标本;③将标本A和标本B配制成不同稀释比例的标本,其中标本A:标本B=0:1的标本为对照标本,其他为干扰标本,重复检测2次取均值,并计算干扰标本和对照标本间的偏差,以此偏差作为干扰值;④以干扰值≤±10%作为是否存在明显干扰的判定标准;⑤干扰值(%)=(干扰标本测定值-对照标本测定值)÷对照标本测定值X100%.配制不同稀释比例的干扰标本见表1.

表1 不同稀释比例干扰标本配置

1.5 统计学方法

所有数据处理均采用Microsoft office EXCEL 2007完成.

2 结果

2.1 不精密度评价实验

低值和高值2个浓度水平的MMP-3质控品日内不精密度分别是4.6%和1.2%,日间不精密度分别是5.8%和2.3%,均低于厂商的不精密度指标,见表2.

表2 不精密度评价实验结果

2.2 准确度评价实验

厂商说明书的准确度性能指标为±20%,采用厂商声明的1/2作为实验室允许偏差.采用批号为815RLM的校准品校准检测系统后,对另一批号为816RBN的校准品进行检测,重复检测3次计算均值.对应的5个不同浓度校准品检测结果均值与标示值的偏差为0.2%~2.3%,均低于实验室规定的允许偏差,见表3.

2.3 测量范围分析评价

以配制好的标本的实测均值为Y,预期值为X,计算线性回归方程Y=bX+a.根据实验数据可以得出线性回归方程为Y=1.03X+5.7,r2=0.9921.相关性系数r2>0.975,直线回归方程b为0.97~1.03,数据组呈线性关系.验证的MMP-3分析测量范围为10.65~1498.05 ng/ml,与试剂说明书指标的10~1600 ng/ml接近,可以接受制造商声明的分析测量范围,见表4.

表3 准确度评价实验结果

表4 测量范围数据分析(ng/ml)

2.4 检出能力评价

试剂说明书声明不精密度目标为10%,声明的测量范围下限为10 ng/ml.对2个浓度在10 ng/ml附近的标本进行连续4 d检测,每日重复5次,计算其不精密度均小于说明书指标的10%,LoQ验证通过,检出能力验证数据见表5.

表5 检出能力验证数据(ng/ml)

2.5 临床可报告范围评价

将3份高值标本以仪器5倍自动稀释检测2次后取均值,结果与原始浓度对比,计算回收率,以回收率为90%~110%之间判定为合格.检测3份标本的稀释回收率均合格,临床可报告范围为10~8000 ng/ml,见表6.

表6 临床可报告范围评价结果

2.6 生物参考区间评价

MMP-3试剂说明书声明的生物参考区间为男性36.9~121.1 ng/ml,女性17.3~59.7 ng/ml,在表观健康体检者检测结果中,仅女性组有2名超出说明书指标的范围,占所有女性组65名体检者的3.1%,而男性组65名结果全部在说明书的范围内,验证合格,可接受厂商指标的生物参考区间.

2.7 分析干扰能力评价

通过添加系列浓度的外源性干扰物对临床常见的胆红素F、胆红素C、血红蛋白和乳糜4种干扰物对MMP-3检测试剂盒的干扰性能评价,以干扰值<10%作为评价标准,实验结果在游离胆红素浓度<20 mg/dl、结合胆红素浓度<20 mg/dl、血红蛋白<500 mg/dl以及乳糜<2000 FTU时对检测结果的影响较小,干扰值均低于10%,见表7~10.

表7 干扰物胆红素F干扰试验结果

表8 干扰物胆红素C干扰试验结果

表9 干扰物溶血血红蛋白干扰试验结果

表10 干扰物乳糜干扰试验结果

3 讨论

随着我国卫生事业的发展,国内检验医学在近20年来取得了长足的进步.当前国际主流的检测设备、体外诊断试剂盒等基本是同步应用于许多国内大中型医院实验室,与此形成鲜明对比的是在实验室质量管理上与国外先进实验室仍存在不小的差距.在美国,《临床实验室改进法规修正案》(CLIA'88)[18]的颁布和不断修订,对实验室的检测质量起到了很好的管理和指导作用,其明确规定了在应用于患者常规报告结果之前,实验室要对检测系统的主要分析性能如不精密度、准确度、分析测量范围/临床可报告范围等进行评价.2006年原国家卫生部颁布《医疗机构临床实验室管理办法》,作出同样规定以保证国内实验室的检测质量.近10年来,随着ISO15189实验室认可在国内日益受重视,广大实验室工作人员也对方法学性能评价有了更多的关注和认识.检测系统的分析性能满足当前临床要求是开展实验室质量管理工作的根本保障,因此在选择和应用新的检测方法之前,应按要求对其进行方法学性能评价,以确认是否能满足临床检测的要求.

本研究依据当前系列行业指南[10-11,14-17]和文献报道,对MMP-3检测系统的不精密度、准确度、分析测量范围、检出能力、临床可报告范围、生物参考区间以及对胆红素、溶血血红蛋白、乳糜颗粒等常见干扰物抗干扰能力进行了初步的评价.实验结果表明,本检测系统日内和日间不精密度均小于试剂说明书声明的10%.准确度评价实验因为当前MMP-3检测无公认的参考物质和参考测量程序,也无合适的室间质量评价材料,所以采用类似校准验证的方式来进行,依据当前技术水平采用说明书声明的准确度性能的1/2来作为评价标准,偏差在允许范围内.分析测量范围、检出能力的评价结果表明,可以接受厂商指标的10~1600 ng/ml作为本方法的分析测量范围.同时通过稀释倍数验证实验结果证明可以将高值标本进行5倍稀释检测,从而将临床可报告范围拓展至10~8000 ng/ml.在表观健康体检者中,65名男性结果全部在说明书指标的范围内,而65名女性中只有2名超出,验证合格.干扰试验结果表明,游离胆红素浓度<20 mg/dl、结合胆红素浓度20 mg/dl、血红蛋白<500 mg/dl以及乳糜<2000 FTU时对检测结果影响轻微.

本研究实验验证了MMP-3检测试剂盒在MODULAR P800型全自动生化分析仪上性能满足或高于试剂说明书指标,可以应用于临床.本研究中采用的评价方法,对基层实验室工作具有一定的参考意义.