一株猫爪草内生真菌红色素稳定性研究

乔新荣，尹伟涛，蒋秋慧

(信阳农林学院 生物与制药工程学院，河南 信阳 464000)

植物内生真菌是指存在于健康植物根、茎、叶等组织部位内部，不会对宿主植物造成明显伤害或者引起宿主植物组织明显病症的真菌。药用植物内生真菌能产生与宿主植物相同、相似或全新的具有药用价值的生物活性物质[1]。目前，内生真菌次生代谢物已成为寻找具有生物活性成分的一种重要来源。产于动、植物及微生物的天然色素与人工合成色素相比，因其安全无毒、色泽鲜艳、并具有营养及药理活性等优点，在食品行业广受青睐，而微生物色素又因微生物生长周期短，便于人工控制生产等优点，已成为天然色素来源的主力军[2-5]。

自然界中能产生色素的微生物繁多，如真菌、酵母菌、细菌等，使用丝状真菌，如曲霉作为食品着色剂的来源已历史悠久[3]。但部分天然色素对光、热、金属离子、pH 等因素敏感而导致稳定性较差，色价会随着环境条件的变化而发生改变[6]，这些因素直接决定了其应用范围。因而，对色素稳定性的研究具有非常重要的意义。药用植物猫爪草(Radix ranunculi ternati)为毛茛科植物小毛茛(Ranunculus ternatus Thunb.)，入药部位是猫爪草的块根，其含有多糖、皂苷、黄酮类、生物碱类、氨基酸等多种活性成分，具有调节免疫、抗氧化、抑菌、抗结核、抗肿瘤等作用[7]。本文以从信阳地区猫爪草根中分离的一株产红色素的内生真菌为材料，对其产的红色素稳定性进行研究，为该色素进一步开发和利用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种 产红色素的猫爪草内生真菌S4，由信阳农林学院生物与制药工程学院微生物实验室分离，根据《真菌鉴定手册》[8]初步鉴定为镰刀菌(Fusarium sp.)。

1.1.2 培养基 PDA 固体培养基，PDB 液体培养基。

1.1.3 主要仪器及试剂 UV-6000紫外-可见分光光度计，数控超声波发生器等仪器；甲醇、乙醇、丙酮、石油醚、乙酸乙酯、葡萄糖等试剂。

1.2 方法

1.2.1 红色素溶解性分析 挑取PDA培养基上生长旺盛的内生真菌S4菌丝，接种于含 250mLPDB培养液的500mL的三角瓶中，于28℃、150rpm 条件下培养 10d，离心，将发酵液和菌丝体分开，留取菌丝体。将湿菌丝用蒸馏水清洗后，滤去水分，称取2g湿菌丝，以1:40(g:V)比例分别加入蒸馏水、甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯及石油醚，超声波提取30min, 离心，留上清液观察颜色的变化。

1.2.2 红色素光谱特征分析 取样品测试液用 UV-6000 型分光光度计在 300～700 nm 范围内，间隔1nm进行扫描，记录数据，利用Origin软件绘图，观察其光谱特征，确定最大吸收峰值。

1.2.3 光对色素的影响 取色素样品溶液，分别置于暗处、室外太阳光、室内自然光、紫外光条件下处理2、4、8h，测定其在最大吸收波长处的吸光度值，并观察光对色素颜色变化的影响。

1.2.4 温度对色素的影响 取色素样品溶液,分别置于4、25、50、100℃下，处理1、2、4h。冷却至常温后，测其在最大吸收波长处的吸光度值，并观察色素溶液颜色的变化。

1.2.5 pH值对色素的影响 用2.5mmol/L的HCl和2.5mmol/L的NaOH 配制不同 pH 值 (1、3、5、7、9、11，13)的溶液，取5ml色素溶液，向其中分别滴加0.2mL不同 pH 值溶液，放置 4 h，测定其在最大吸收波长处的吸光度值并观察色素颜色的变化。

1.2.6 金属离子对色素的影响 配制2.5mmol/L的NaCl、KCl、MgSO4、CaCl2、FeSO4、CuSO4、MnSO4及ZnSO4溶液，各取0.2mL分别加入5ml色素溶液中，以加0.2ml去离子水为对照。充分溶解后，室温下静置4h。测定在最大吸收波长处的吸光度值并观察色素颜色的变化。

1.2.7 氧化还原剂对色素稳定性的影响 取5mL色素溶液，分别加入 0.2mL 浓度为5%的H2O2、5%的NaClO溶液、5%的Vc溶液以及0.2ml去离子水。室温静置4h，测定在最大吸收波长处的吸光度值并观察色素颜色的变化。

1.2.8 常见添加剂对色素稳定性的影响 配制2.5mmol/L的葡萄糖、蔗糖及乳糖溶液，各取0.2mL分别加入5ml色素溶液中，以加0.2ml去离子水为对照。充分溶解后，室温下静置4h。测其在最大吸收波长处的吸光度值并观察色素溶液颜色变化。

2 结果与分析

2.1 红色素溶解性分析

从药用植物猫爪草根中分离了一种产红色素的内生真菌镰刀菌S4，菌落形态及产色素颜色如图1，真菌菌落表面呈黄色，边缘呈粉紫色，而背面产生大量的红色素。将红色素湿菌丝用蒸馏水清洗后，分别加入蒸馏水、甲醇、无水乙醇、丙酮、乙酸乙酯及石油醚，超声波提取30min。过滤后观察溶液颜色的变化(表1)，发现该色素易溶于丙酮。 因此后续试验用丙酮提取液进行各项指标的测定。

图1 菌落形态与提取色素

溶剂种类蒸馏水甲醇无水乙醇丙酮乙酸乙酯石油醚甲醇和丙酮混合物溶解性可溶可溶可溶易容微溶不容可溶溶解颜色红色红色红色深红色橘黄色无色红色

2.2 产红色素光谱特征分析

对菌株S4红色素样品进行300～700nm波长范围内，间隔1nm进行扫描，测定在波长515nm处有一最大吸收峰(图2)。因此，测定515nm处色素光吸收值的变化进行该色素稳定性的研究。

2.3 色素稳定性研究结果分析

2.3.1 光对红色素稳定性的影响 由图3可知，随处理时间的延长，室外光、室内光、紫外光及黑暗条件下色素样品的吸光值无显著变化，只有暗条件下略有增加。由此可知， S4菌株红色素对光照不敏感，黑暗条件下有增色护色作用。观察色素颜色也无明显变化。

2.3.2 温度对色素稳定性的影响 从图4测得的吸光度可知，该色素在 4～100℃范围内温度的变化对色素的稳定性无太大影响，当50℃条件下，随处理时间的延长，吸光度略增加，而100℃时，略下降，但无显著变化。从观察到的色素颜色也无明显区别。由此表明，该色素耐热性极好。

图2 S4菌株红色素吸收光谱 图3光对色素稳定性的影响

2.3.3 pH对色素稳定性的影响 由图5可看出，pH值小于7的酸性条件，色素吸光度偏低，观察到色素颜色随酸性的增强，呈橘红色-橘黄色-浅黄色变化的趋势。在碱性条件下，随pH逐渐增加，吸光度增强，红色色素逐渐加深。表明该色素对酸敏感，碱性条件下有增色护色效应。

图4温度对色素稳定性的影响 图5 ph对色素稳定性的影响

2.3.4 金属离子对色素稳定性的影响 由图6可以看出，添加金属离子Na+、Mn2+、K+后，与对照CK相比，其吸光度无明显变化，观察到色素颜色与对照比较，也无明显变化，表明这些金属离子对该色素无影响。添加金属离子Ca2+、Fe2+后，吸光度略增加，红色素提取液的红色也略加深，表明其具有一定的增色作用。添加金属离子Mg2+、Zn2+、Cu2+可使红色色素溶液颜色变成橘黄色，表明红色素提取液对Mg2+、Zn2+、Cu2+较敏感。

2.3.5 氧化还原剂对色素稳定性的影响 由图7可以看出 ，还原剂Vc和氧化剂H2O2的吸光值比对照小，观察到红色素的颜色也由红色变为橘黄色。但氧化剂NaClO溶液吸光值明显增强，色素颜色也加深。进一步表明，NaClO作为碱性氧化剂，该色素在碱性条件下，可以避免氧化剂对色素的干扰，起到护色增色作用。

图6金属离子对色素稳定性的影响 图7氧化还原剂对色素稳定性的影响

2.3.6 常见添加剂对色素稳定性的影响 由图8可以看出，添加葡萄糖后，吸光度值略升高，色素溶液颜色与对照相比，无明显变化。添加蔗糖、乳糖后，其吸光度值略下降，色素溶液颜色也无显著变化。由此表明，理论上，该色素对这三种常用食品添加剂较稳定，该色素具有作为一般食品添加剂的潜力。

图8常见食品添加剂对色素稳定性的影响

3 结论与讨论

该色素对光、热、碱、碱性氧化剂NaClO、金属离子(Ca2+、Fe2+，Na+、Mn2+、K+)以及常见食品添加剂(葡萄糖、蔗糖、乳糖)较稳定。对酸、Mg2+、Zn2+、 Cu2+、还原剂Vc及氧化剂H2O2较敏感。前期对菌株S4的抑菌活性进行了测定，结果表明该菌株有较强的抗金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)及抗核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)、灰葡萄孢菌 (Botrvtis cinerea)等病原菌的作用(未发表)。又因该菌是从药用植物猫爪草中分离，猫爪草的多种生理活性赋予了与其共生的S4内生真菌菌株具有一定的药理应用潜力。下一步将从该真菌色素的抑菌[9]、抗氧化[10]、保健等生物活性方面进行深入研究，为其应用于食品添加剂、医药卫生等方面奠定基础。