针刺对关节炎模型大鼠炎性因子水平、抗炎免疫及抗炎镇痛反应的影响*

范 洁,王 波,姜迎萍

(新疆维吾尔自治区中医医院，新疆 乌鲁木齐 830001)

关节炎泛指发生在人体关节及其周围组织，由炎症、创伤、感染等多种因素引发的炎性疾病[1-3]，我国关节炎患者总人数仍在逐年增加，位居自身免疫性结缔组织病首位[4]，晚期导致关节僵硬至变形，甚者导致患者残废，严重影响患者生存质量。临床西医常采用非甾体抗炎药、DMARDs及生物制剂等传统治疗方法[5-7]，长期服用不仅价格昂贵，且给患者带来较大不良反应。从中医角度论治，本病属“痹证”范畴，又在文献中被描述为“尪痹”“顽痹”“历节”“痛风”“骨槌风”等[8]，近年来关于针灸医治关节炎动物研究进展迅速，为临床治疗关节炎、缓解病症、提高患者生存质量并降低不良反应等方面提供理论依据。另一方面，关节炎的发生发展是由一系列细胞因子的变化所引起的炎症反应积聚病变，而针灸腧穴可能通过抑制TNF、IL-1等炎症因子的释放发挥抗炎免疫作用[9-10]，因此，本研究基于佐剂关节炎大鼠模型，观察针刺对模型鼠炎性因子表达、抗炎免疫及抗炎镇痛反应的作用，为中医针灸治疗关节炎提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

弗氏完全佐剂(美国西格玛奥德里奇公司)；华佗牌0.25 mm×13 mm不锈钢针灸毫针(苏州医疗用品厂有限公司)；NO、SOD、MDA试剂盒(南京建成生物工程研究所)；大鼠IL-1、TNF-α ELISA检测试剂盒(上海北诺生物科技有限公司)；冰乙酸(分析纯，天津广成化学试剂有限公司)；泰盟PL-200型热刺痛仪(成都泰盟科技有限公司)。

1.2 实验动物和分组干预

1.2.1 实验动物 无特定病原体(SPR)级Wister大鼠30只，体质量(200±20)g，实验动物购自新疆医科大学实验动物中心。大鼠饲养于SPF级实验动物中心分笼饲养，饲养环境为12 h恒温(25±1)℃、恒湿50%～70%,昼夜节律交替，适应性喂养1周后正式开始实验，实验操作严格遵守动物伦理保护法等相关规定。

1.2.2 实验分组及造模 适应性喂养后随机将大鼠分为正常组、模型组和针刺组，每组10只。模型组和针刺组大鼠采用5%水合氯醛以0.8 mL/100 g浓度比例腹腔注射麻醉，取弗氏完全佐剂0.1 mL，对大鼠右后足跖底部采用75%酒精消毒3遍，将佐剂皮内注射至踝关节处，模拟关节炎模型。以24 h内出现右侧足部急性炎症肿胀，48 h内全身出现继发性关节炎为标志，观察造模后3天大鼠前肢或对侧肢体红肿及炎症结节出现情况，出现上述情况则视为造模成功。正常组大鼠不做任何处理。

1.2.3 治疗方法 判定造模成功后隔日将针刺组大鼠呈俯卧位束于固定器中，外展拉直并固定四肢，局部剃毛处理。75%酒精消毒皮肤3次，用棉棒蘸取碘伏分别在足三里、阳陵泉和昆仑穴3处标记，穴位标记参照林文注主编的《实验针灸学》[11]图谱定位，取13 mm长毫针迅速刺入大鼠上述3处穴位中10 mm，留针30 min后出针，再次消毒后将大鼠放回笼中饲养，饲养条件不变。2天施针1次，3周后结束治疗。正常组及模型组大鼠不做任何处理。

1.3 大鼠行为学实验

1.3.1 大鼠醋酸扭体反应实验 最后1次针刺治疗结束后1 h，以0.2 g/kg比例给予各组大鼠1%冰醋酸腹腔注射，醋酸溶液现用现配。注射完成后将大鼠放于空旷饲养笼中，计时10 min观察并记录大鼠出现扭体反应次数，其中扭体反应包括：蠕行、腹部收缩内凹、后肢伸展及臀部抬高等。

1.3.2 热板致痛实验 醋酸扭体反应实验结束后平静大鼠恢复至正常状态，1～2 h后将各组大鼠置于热板上加热保持温度在(55.0±0.5)℃，观察并记录1 min内大鼠从接触热板到舔后足的时间，1 min内无明显疼痛反应产生则取出大鼠终止实验，以上述记录的时间作为各组大鼠的痛阈值。

1.4 血清一氧化氮(NO)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)含量检测

实验治疗3周后5%水合氯醛腹腔麻醉大鼠，行仰卧位固定大鼠经腹主动脉采血3 mL，静置沉淀1 h后4 000 r/min低速离心10 min，分离上层血清，参照NO、SOD、MDA检测试剂盒说明书分别采用硝酸还原酶法、羟胺法及硫代巴比妥酸(TBA)法测定血清内NO、SOD、MDA含量变化。

1.5 大鼠免疫器官系数检测

完成上述行为学实验后称重记录大鼠体质量(g)，颈椎脱臼处死大鼠，分别取大鼠脾脏、胸腺及炎症病变组织标本，炎症病变组织标本称重后快速降温置于液氮中冷冻保存。胸腺及脾脏新鲜称取湿重，记为脏器质量(mg)，以计算胸腺、脾系数，公式如下：脏器系数=脏器质量(mg)/体质量(g)。

1.6 HE染色观察大鼠滑膜组织病理学状态

参考文献方法，取各组大鼠关节完整滑膜组织，4%多聚甲醛固定液4℃浸泡固定过夜，行常规石蜡包埋及切片，经苏木素伊红(HE)染色后于光学显微镜下观察各组大鼠滑膜组织病理学改变情况。

1.7 大鼠组织炎性因子表达测定

取冻存的炎症病变组织融化后加入1 mL预冷的PBS冰浴充分匀浆，2 500 r/min低速离心20 min，取上清液转移至新的1.5 mL EP管中，参照双抗夹心ELISA法检测取适量组织上清液于检测板孔内，检测各组大鼠肌肉组织中IL-1、TNF-α表达差异。

1.8 统计分析

2 结果

2.1 滑膜组织病理变化比较

HE染色观察大鼠后肢关节滑膜组织病理变化，如封三彩图1所示，光镜下正常组大鼠关节滑膜组织细胞排列整齐，细胞形态规则，细胞核分布有序，无明显病变。模型组大鼠滑膜组织区域细胞结构紊乱，部分可见细胞坏死，同时出现大量炎性细胞浸润，组织水肿伴随严重纤维坏死，由此可说明佐剂关节炎模型造模成功。给予针刺治疗3周后，可见滑膜组织细胞病变有一定程度的改善，滑膜组织略增厚，细胞边缘少见不平整，局部残有炎性细胞浸润，整体组织结构基本完整，针刺后改善大鼠关节滑膜组织形态。

2.2 3组大鼠醋酸扭体反应次数和热板反应时间比较

与正常组相比，模型组大鼠醋酸扭体反应明显(P<0.05)；给予针刺治疗后，针刺组大鼠醋酸扭体反应显著低于模型组(P<0.05)，且与正常组大鼠无显著性差异。模型组大鼠痛阈值显著低于正常组(P<0.05)；给予针刺治疗后，大鼠痛阈值有明显的改善，针刺组较模型组显著提高(P<0.05)，但仍低于正常组(P<0.05)。详见表1。

表1 针刺治疗对大鼠醋酸扭体反应和热板反应的影响

注：与正常组相比，#P<0.05；与模型组相比，*P<0.05。

2.3 3组大鼠血清NO、SOD、MDA含量比较

ELISA检测3组大鼠血清中NO、SOD、MDA含量变化，验证抗自由基损伤作用。如表2所示，模型组较正常组大鼠血清NO、MDA含量显著升高，血清SOD显著降低(P<0.05)。给予针刺治疗后，以上指标较模型组明显改善(P<0.05)。

表2 针刺治疗对大鼠血清内NO、SOD、MDA含量的影响

注：与正常组相比，#P<0.05；与模型组相比，*P<0.05。

2.4 3组大鼠免疫器官系数比较

模型组大鼠胸腺系数较正常组显著降低，脾系数较正常组大鼠显著升高(P<0.05)；给予针刺治疗后，针刺组大鼠脾系数较模型组显著升高，而胸腺系数较模型组显著降低(P<0.05)，详见表3。

表3 针刺治疗对大鼠免疫器官系数的影响

注：与正常组相比，#P<0.05；与模型组相比，*P<0.05。

2.5 3组大鼠肌肉病变组织IL-1、TNF-α含量比较

如表4可见，模型组大鼠肌肉病变组织中IL-1、TNF-α含量均较正常组存在显著性差异(P<0.05)；针刺干预在一定程度缓解模型大鼠炎性因子表达量，病变区域组织内IL-1、TNF-α含量较模型组显著降低(P<0.05)。

表4 针刺治疗对大鼠炎症组织IL-1、TNF-α含量变化的影响

注：与正常组相比，#P<0.05；与模型组相比，*P<0.05。

3 讨论

关节炎的发病机制目前尚未明确，我国中医认为该病源于正虚邪侵，虚实夹杂，正气虚损，腠理不固，致使风寒湿热之邪乘虚而入，壅塞经络，久而为痹[12]，同时现代研究表明，针灸可通过发挥抗炎效应、调节神经-内分泌-免疫网络系统、影响神经递质及自由基调控镇痛等途径对关节炎产生治疗作用[13]。本实验取足三里、阳陵泉和昆仑穴3处。阳陵泉穴，为胆经之合穴、胆之下合穴，《铜人腧穴针灸图经》记载其具有“治膝伸不得屈，冷痹脚不仁”的作用；足三里为足阳明胃经之穴，燥化脾湿，生发胃气，作为膀胱经的经穴，能治疗经脉循行所过之处的疾病，《灵枢·四时气》记载:“着痹不去，久寒不已，率取其三里”；昆仑穴[14]为足太阳膀胱经的经穴，针灸昆仑穴可通利经脉气血，可奏通则不痛之效，发挥抗炎镇痛的作用。由此，以针刺施治上述穴位，进一步探究中医针灸对模型大鼠炎性因子水平、抗炎免疫及抗炎镇痛反应的作用。

HE染色观察大鼠后肢关节滑膜组织病变结果显示，针刺治疗后实验组大鼠较模型组大鼠滑膜组织病理改变得到缓解，关节处细胞排列较为规则，有清晰的细胞形态，同时炎性细胞浸润情况减少。IL-1、TNF-α的积聚表达可进一步刺激并加速软骨破坏和局部组织纤维增生，诱发机体效应器发生急性期反应，最终导致炎性爆发[15-16]。在本研究中针刺干预3周后，实验组大鼠肌肉组织中IL-1、TNF-α含量较模型组显著降低，提示针刺施治足三里等穴可能通过降低IL-1、TNF-α等炎症因子趋化反应阻断其介导的免疫反应，从而发挥抗炎镇痛作用。由此，进一步通过检测针刺对免疫器官系数的影响和抗自由基损伤作用。脏器系数尤其胸腺及脾脏系数是衡量动物体免疫功能的重要直标，该值增大表示脏器可能存在充血、水中或增生的异常现象，而系数降低则暗示动物体可能出现脏器萎缩及其他退行性改变，在本实验中，模型组大鼠胸腺系数显著降低，针刺则能治疗关节炎模型造成的胸腺系数降低的情况，而胸腺是分泌产生T淋巴细胞和胸腺素的重要器官，该脏器指数在一定程度上预示着动物体免疫功能的强弱，由此进一步验证了针灸施治足三里、阳陵泉和昆仑穴能促进胸腺功能恢复从而促进机体抗炎免疫的进程。另一方面，NO作为一种重要的炎症介质不仅直接参与关节损伤过程，其在体内的积聚更会加剧炎性级联反应[17]，同时，动物体内自由基作用于脂质发生过氧化反应诱导氧化产物丙二醛(MDA)的积聚，产生细胞毒作用，对大鼠的炎性反应及生存状态产生重要影响，在本实验中针刺能够显著抑制体内NO及MDA的积聚，同时促进超氧化物歧化酶(SOD)含量上升，起到清除体内自由基积聚、抑制炎症反应发生的作用，作用促进关节炎模型大鼠抗自由基损伤作用和细胞毒性抑制，进一步减轻免疫炎症并弱化疼痛反应的发生。最后通过醋酸致大鼠扭体实验及热板致痛实验进一步验证大鼠痛阈值及疼痛反应产生发生次数，研究发现针刺施治足三里、阳陵泉、昆仑穴可以显著改善大鼠疼痛反应发生并较模型组痛阈值有一定程度的提升，针刺促进关节炎模型大鼠抗炎镇痛反应效果增加。

综上，本研究证实了针刺施治足三里、阳陵泉、昆仑穴3穴可有效地改善大鼠炎性因子表达水平、促进抗炎免疫及抗炎镇痛反应发生，其机制可能与足三里健脾益气、昆仑穴消肿止痛、阳陵泉通经散瘀等作用有关，三者相辅相成，抑制炎证级联反应、促进抗炎物质分泌，共同介导神经-内分泌-免疫调控网络，最终起到治疗缓解关节炎症的作用，为临床针灸施治关节炎提供了有力的科学依据。