芸苔素内酯对连作及非连作紫花苜蓿生产调控初探

苏一诺， 苗阳阳， 彭芳华， 曲善民

(黑龙江八一农垦大学动物科技学院草业科学系，黑龙江大庆 163319)

紫花苜蓿(MedicagosativaL.)为多年生优质牧草，是世界范围内广泛利用的豆科饲料作物，营养价值好，蛋白质含量高，氨基酸组成仅次于鱼粉，必需氨基酸比例均衡，微量元素丰富，色素多样化[1]，各种畜禽均喜食，被称为牧草之王。随着畜牧养殖业不断发展，苜蓿商品草需求量逐年大幅度增加,促使紫花苜蓿种植面积、草种用量大幅提升[2]。随着苜蓿连作年限的增加，用地不养地、土壤有益微生物的减少、有害微生物的增加、土传病害的加重、地下营养物质的损失、有病虫害、作物自毒现象的发生、元素平衡的破坏等一系列原因，最终形成连作障碍[3]。连作障碍是指同种或同科近缘作物连续种植多年造成作物生长发育受阻，即使在正常维护管理情况下，也会出现植株矮小、叶子枯黄、根系腐烂、产量质量下降等状况，导致连作苜蓿地苜蓿草的生产性能普遍降低[4]。在连作情况下，作物的根、叶、茎会产生有毒物质进入土壤，对植株产生抑制作用，同时会结合有害微生物一同影响作物生长发育[5]。作物生长发育时会吸收较多的氮、磷、钾等物质，长期连作造成土壤营养元素亏缺，有机质减少，通透性降低等[6]。

苜蓿因具有突出的经济效益、生态效益及生态幅宽泛等优点，在我国绝大多数草原区草原改良建设中成为重要的首选播种牧草。草原承包种植户进行苜蓿草原改良项目实施或多或少享受国家草原改良的定向政策照顾和资金扶持。随着紫花苜蓿生长年限的延长，生产力会逐年降低甚至出现“自疏”现象，因此低产低盖度的苜蓿田必须进行重耕再播。苜蓿田轮作一年生禾本科谷物具有技术可行性特点，但为了防止改变草原用途和产生开荒耕田，在《草原法》和《黑龙江草原管理条例》中明令禁止该种植模式，因此，研究苜蓿连作障碍已成为草原区牧草业生产的一种关键攻关手段。

芸苔素内酯(Brassinolide)简称BR，是1种新型绿色环保植物生长调节剂，具有高效、广谱、无毒等特征，是被全世界公认的第6大类植物激素[7]。BR可促进植物根系吸水性能，稳定叶片、植株膜系统的结构功能，维持植物较高的能量代谢，调节细胞内生理环境，促进细胞的分裂和延长，增强叶片中色素的合成能力，提高叶绿素含量，促进植物新陈代谢，辅助劣势作物部分良好生长，增强植物逆环境中的抵御能力[8]。BR能提高植物抗病毒能力，它在植物体内具有平衡输送养分功能，能促进植株生理生化代谢，从而提高植物抗病能力，植株抵抗力增加使得病原菌难以入侵，病毒感染力随之下降[9]。近年来关于BR在农作物上的研究，主要集中在对玉米(ZeamaysL.)、小麦(TriticumaestivumL.)、水稻(OryzasativaL.)、及蔬菜类生长的影响，而关于对连作尤其是苜蓿连作的研究较少。因此本试验在盆栽苜蓿中喷施适宜浓度BR，研究其对紫花苜蓿连作障碍及对生长调控效应的影响，为提高连作紫花苜蓿的草产量及品质奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试苜蓿：试验所用紫花苜蓿品种为龙牧801，由黑龙江省畜牧研究所李红研究员、柴凤久研究员提供。

供试土壤：来自黑龙江八一农垦大学动物科技学院草业科学专业紫花苜蓿试验田(连作土壤)及禾本科试验田(非连作土壤)。试验田地理位置为北纬46°55'，东经125°15'，地处北温带大陆性季风气候区，受蒙古内陆冷空气和海洋暖流季风的影响，总体特点是冬季寒冷有雪；春秋季风多；全年无霜期较短；雨热同季，有利于农作物和牧草生长。连作7年苜蓿土壤理化性质：pH值为7.46，有机质为40.82 g·kg-1，全氮4.04g ·kg-1，全磷0.38 g·kg-1，全钾8.45 g·kg-1，碱解氮173.83 mg·kg-1，速效磷8.15 mg·kg-1，速效钾129.20 mg·kg-1。非连作壤理化性质：pH值为7.75，有机质为35.52 g·kg-1，全氮2.82 g·kg-1，全磷0.28 g·kg-1，全钾8.88 g·kg-1，碱解氮129.50 mg·kg-1，速效磷7.28 mg·kg-1，速效钾184.32 mg·kg-1。

供试芸苔素内酯购买于山东潍坊双星农药有限公司，水剂，有效成分含量0.0016%。

1.2 试验方法

BR浓度设置：浓度为稀释0(清水作为CK)，0.25‰，0.50‰，0.67‰，1‰V/V溶液。

选取籽粒饱满、表面完好的紫花苜蓿种子，用 0.1%HgCl2溶液消毒5～8 min，自来水冲洗3 ～ 4次，分为5组，每组为120粒，将种子放入铺好滤纸培养皿中，编号为1，2，3，4，5。在试验盆内(上口径长40 cm，宽30 cm，高13 cm，底部尺寸长33 cm，宽22 cm)进行播种，种子总数为120粒，每盆播种40粒，每行10粒，3个重复。待苜蓿分枝期进行不同浓度叶部均匀喷施BR。喷施时间为上午9点前，下午4点后，无风无雨天，在喷施后间隔5 ～7 d进行1次补喷，整个期间共喷施2次。连作和非连作盆栽每个浓度处理为3盆，5个梯度，共30盆。在现蕾期对生长在连作和非连作土上种植的苜蓿进行取样测定各指标。

1.3 测定指标与方法

形态指标测定：在各处理浓度中每盆每行随机选取3株苜蓿进行株高、根长、分枝数、节间数的测定。每处理浓度中每盆随机选取10株苜蓿[10-11]，称量鲜重和干重(烘箱中105 ℃杀青20 min，80℃烘干至恒重)[12]。以上数据均测定三个重复。

生理指标测量：过氧化物酶(Peroxidase，POD)活性测定—愈创木酚法，超氧化物歧化酶(Superoxidedismutase，SOD)活性测定—氮蓝四唑法，丙二醛(Malondialdehyde，MDA)含量的测定—TBA法[13]，可溶性糖(Soluble suger，SS)含量的测定—蒽酮法[14]，脯氨酸(Proline)含量的测定—酸性茚三酮比色法[15]，叶绿素(Chlorophyll)含量的测定—SPAD-502叶绿素仪[16]。

1.4 数据分析

采用Excel2013和SPSS17.0进行数据处理和分析，Origin9.1软件进行图表绘制。

2 结果与分析

2.1 BR溶液对紫花苜蓿生物学指标的影响

2.1.1对株高和根长的影响 如图1所示，非连作和连作苜蓿，经不同浓度BR处理后，株高呈先上升后下降的趋势。非连作苜蓿喷施浓度为0.50‰，0.67‰时株高显著高于CK(P<0.05)，提高了10%～11%；连作苜蓿喷施浓度为0.50‰时株高达最高，显著高于CK(P<0.05)，提高了37%。

喷施BR后的苜蓿，根长的变化如图2所示。非连作苜蓿，随BR喷施浓度的增加根长逐渐增加，当浓度为0.50‰，0.67‰时根长显著高于CK(P<0.05)，提高了5%～14%；浓度为1‰时根长显著低于CK(P<0.05)；连作苜蓿喷施浓度0.25‰，0.50‰和0.67‰时根长均显著高于CK(P<0.05)，提高了22%～48%；在连作情况下，0.50‰喷施浓度处理后根长增加最明显。

图1 不同浓度BR对紫花苜蓿株高的影响Fig.1 Effects of different concentrations of BR on alfalfa plant height

2.1.2对苜蓿分枝数与节间数影响 经不同浓度BR处理之后，非连作和连作苜蓿分枝数的变化如图3所示。非连作苜蓿喷施浓度为0.25‰，0.67‰时分枝数显著高于CK(P<0.05)，喷施浓度为0.50‰时分枝数与CK相比有增高的表现但无显著差异，BR浓度为1‰时苜蓿的分枝数与CK相比无显著差异；连作苜蓿随喷施BR的浓度增加分枝数逐渐增多，至0.50‰，0.67‰时分枝数显著高于CK(P<0.05)，当BR浓度为1‰时分枝数低于CK，但二者无显著差异。

图2 不同浓度BR对紫花苜蓿根长的影响Fig.2 Effects of different concentrations of BR on alfalfaroot length注:同一喷施处理不同浓度下小写字母表示在0.05水平上差异显著。下同Note:Different lowercase letters in the same treatment and different concentrations indicate significant difference at the 0.05 level. The same as below

喷施不同浓度BR对苜蓿节间数的变化如图4所示。非连作苜蓿喷施浓度为0.50‰时节间最多，显著高于CK(P<0.05)，其他三个浓度处理的节间数与CK无显著差异；连作苜蓿喷施浓度为0.25‰，0.50‰和0.67‰时节间数显著高于CK(P<0.05)，喷施浓度为1‰时节间数与CK无显著差异。

图3 不同浓度BR对紫花苜蓿分枝数的影响Fig.3 Effects of different concentrations of BR on alfalfa shoot number

图4 不同浓度BR对紫花苜蓿节间数的影响Fig.4 Effects of different concentrations of BR on alfalfa node number

2.1.3对苜蓿全株生物量影响 苜蓿经不同浓度的BR处理后，鲜重变化如图5所示。非连作苜蓿喷施浓度为0.25‰，0.50‰时鲜重显著高于CK(P<0.05)，提高了8%～16%；而随着浓度增大到0.67‰，1‰时鲜重显著低于CK；连作苜蓿仅在浓度为0.50‰时鲜重积累最多，显著高于CK(P<0.05)，提高了17%，其余浓度处理后鲜重显著低于或与CK无显著差异。

苜蓿干重变化如图6所示。随BR浓度的增加，非连作苜蓿全株干重逐渐增加，当BR浓度为0.50‰时干重达最高，显著高于CK(P<0.05)，提高了51%，然后干重逐渐下降；连作苜蓿喷施浓度为0.25‰，0.50‰时干重显著高于CK(P<0.05)，提高了33%～42%；然后随BR浓度的增加干重逐渐降低。

图5 不同浓度BR对紫花苜蓿鲜重的影响Fig.5 Effects of different concentrations of BR on alfalfa fresh weight

2.2 BR溶液对紫花苜蓿生理指标的影响

2.2.1对苜蓿根、叶过氧化物酶(POD)活性影响 非连作和连作的苜蓿，经不同BR浓度处理后，根中POD活性如图7所示。非连作苜蓿喷施不同浓度的BR时，根中POD活性均显著高于CK(P<0.05)，但当浓度为0.50‰时POD活性达最高，显著高于其他浓度处理(P<0.05)；连作苜蓿除浓度为1‰的BR处理外，其他浓度处理后根POD均显著高于CK(P<0.05)。

图6 不同浓度BR对紫花苜蓿干重的影响Fig.6 Effects of different concentrations of BR on alfalfa dry weight

不同浓度BR溶液处理后，苜蓿叶中POD活性如图8所示。非连作苜蓿喷施不同浓度BR后叶片POD均显著高于CK(P<0.05)，当浓度为0.50‰时叶中POD活性达最高，显著高于其他浓度(P<0.05)；连作苜蓿除喷施1‰BR处理外，其他浓度下叶中POD均显著高于CK(P<0.05)。

图7 不同浓度BR对紫花苜蓿根POD活性的影响Fig.7 Effects of different concentrations of BR on alfalfa roots POD activity

图8 不同浓度BR对紫花苜蓿叶POD活性的影响Fig.8 Effects of different concentrations of BR on alfalfa leaves POD activity

2.2.2对苜蓿根、叶超氧化物歧化酶(SOD)活性影响 非连作和连作的苜蓿，经不同BR浓度处理后，根中SOD活性如图9所示。非连作苜蓿喷施浓度为0.25‰，0.50‰时SOD活性显著高于CK(P<0.05)，但当浓度为0.50‰时SOD活性达最高，显著高于其他浓度处理(P<0.05)，随浓度增加在浓度为0.67‰，1‰时与CK相比SOD活性下降；连作苜蓿喷施不同浓度BR后，均显著高于CK(P<0.05)，在浓度为0.50‰时SOD活性达最高。

经不同BR浓度处理之后，苜蓿叶中SOD活性如图10所示。非连作苜蓿喷施浓度为0.25‰，0.50‰时SOD活性显著高于CK(P<0.05)，喷施浓度为0.67‰时SOD活性与CK无显著差异，喷施浓度在1‰时与CK相比SOD活性下降；连作苜蓿喷施各浓度的BR溶液均显著高于CK(P<0.05)，在喷施浓度为0.25‰，0.50‰处理后，叶中SOD活性较高，显著高于其他浓度处理(P<0.05)。

图9 不同浓度BR对紫花苜蓿根SOD活性的影响Fig.9 Effects of different concentrations of BR on alfalfa roots SOD activity

图10 不同浓度BR对紫花苜蓿叶SOD活性的影响Fig.10 Effects of different concentrations of BR on alfalfa leaves SOD activity

2.2.3对苜蓿根、叶丙二醛(MDA)含量影响 经不同BR浓度处理之后，检测苜蓿MDA含量，MDA含量越高，苜蓿的抗逆性越差，受害程度越高，反之，MDA含量越低，抗逆性越强，受害程度越小。

非连作和连作苜蓿经BR处理后，根中MDA含量如图11所示。非连作苜蓿喷施浓度为0.50‰，0.67‰和1‰时与CK相比MDA降低明显(P<0.05)，在喷施浓度为0.50‰时MDA含量最低；连作苜蓿喷施浓度为0.25‰，0.50‰和0.67‰时与CK相比MDA含量显著降低(P<0.05)，喷施浓度为0.50‰时MDA含量降幅最大。

经不同BR浓度处理之后，叶中MDA含量如图12所示。非连作苜蓿喷施浓度为0.50‰时MDA含量与CK相比显著降低(P<0.05)，喷施浓度在0.67‰时MDA含量与CK无明显差异，喷施浓度在1‰时MDA含量增加；连作苜蓿经不同浓度BR处理后均显著低于CK(P<0.05)，喷施浓度为0.50‰时MDA含量降幅最明显。

图11 不同浓度BR对紫花苜蓿根丙二醛含量影响Fig.11 Effect of different concentrations of BR on alfalfa roots MDA content

图12 不同浓度BR对紫花苜蓿叶丙二醛含量影响Fig.12 Effects of different concentrations of BR on alfalfa leaves MDA content

2.2.4对苜蓿根、叶可溶性糖含量影响 经不同BR浓度处理之后，检测苜蓿中可溶性糖含量，糖对植物有供能的作用，促进苜蓿生长发育，糖含量越高供能越多，长势越好。

非连作和连作苜蓿经BR处理后，根中可溶性糖含量如图13所示。非连作苜蓿喷施各浓度后可溶性糖含量均显著高于CK(P<0.05)，在喷施浓度为0.50‰时，可溶性糖积累明显含量最高；连作苜蓿喷施BR浓度为1‰时可溶性糖含量与CK相比无显著变化，其他浓度处理后可溶性糖含量均显著高于CK(P<0.05)，喷施浓度为0.50‰时可溶性糖含量最高。

经不同BR浓度处理后，苜蓿叶中可溶性糖含量如图14所示。非连作和连作苜蓿在各浓度处理后可溶性糖含量显著高于CK(P<0.05)，均在喷施浓度为0.50‰处理时，可溶性糖含量最高。

图13 不同浓度BR对紫花苜蓿根可溶性糖含量影响Fig.13 Effects of different concentrations of BR on alfalfa roots soluble sugar content

图14 不同浓度BR对紫花苜蓿叶可溶性糖含量影响Fig.14 Effects of dferent concentrations of BR on alfalfa leaves soluble sugar content

2.2.5对苜蓿根、叶脯氨酸含量影响 经不同BR浓度处理之后，检测苜蓿脯氨酸含量。苜蓿在逆境情况下，脯氨酸含量提升，有助于苜蓿稳定增长。

非连作和连作苜蓿经BR处理后，根中脯氨酸含量如图15所示。非连作苜蓿喷施浓度为0.25‰，0.50‰时脯氨酸含量显著高于CK(P<0.05)，但浓度为0.50‰时脯氨酸含量最高，喷施浓度为0.67‰时脯氨酸含量与CK相比无显著变化，喷施浓度为1‰时脯氨酸含量与CK相比降低；连作苜蓿喷施浓度为0.25‰，0.50‰时脯氨酸含量显著高于CK(P<0.05)，喷施浓度为0.67‰时与CK相比脯氨酸含量无显著变化，喷施浓度为1‰时脯氨酸含量与CK显著降低。

经不同BR浓度处理后，叶中脯氨酸含量如图16所示。非连作苜蓿喷施浓度为0.25‰，0.50‰和0.67‰时脯氨酸含量显著高于CK(P<0.05)，但在浓度为0.50‰时脯氨酸含量达最高，显著高于其他浓度处理(P<0.05)，喷施浓度为1‰时脯氨酸含量与CK相比显著降低；连作苜蓿喷施浓度为0.25‰，0.50‰和0.67‰时脯氨酸含量显著高于CK(P<0.05)，喷施浓度为1‰时与CK相比脯氨酸含量无显著变化。

图15 不同浓度BR对紫花苜蓿根中脯氨酸含量影响Fig.15 Effect of different concentrations of BR on alfalfa roots proline content

图16 不同浓度BR对紫花苜蓿叶中脯氨酸含量影响Fig.16 Effects of different concentrations of BR on alfalfa leaves proline content

2.2.6对苜蓿叶绿素含量影响 经不同浓度BR处理后，连作和非连作苜蓿叶绿素含量如图17所示。非连作苜蓿喷施各浓度BR时叶绿素含量可显著高于CK(P<0.05)，提高了2%～9%；但浓度为0.50‰时叶绿素含量达最高，显著高于其他浓度处理(P<0.05)；连作苜蓿喷施浓度为0.25‰，0.50‰和0.67‰时叶绿素含量显著高于CK(P<0.05)，提高了15%～23%；喷施浓度为1‰时与CK相比叶绿素含量无显著差异，但浓度为0.50‰时叶绿素含量增加最明显，含量最高。

图17 不同浓度BR对紫花苜蓿叶绿素含量影响Fig.17 Effects of different concentrations of BR on alfalfa chlorophyll content

3 讨论

苜蓿连作障碍是当前亟待解决的问题，长期连作紫花苜蓿生产性能会降低，生长缓慢、叶片枯黄、根系腐烂、品质下降。克服或缓解连作障碍的方式主要有轮作、套作、生物防治、抗性品种筛选等，但在实际应用中，出现改良期间过长、资金成本增加、效果不显著、应用技术不成熟等因素导致连作障碍无法克服[17]。芸苔素内酯是1种新型绿色环保植物生长调节剂，提取于油菜花，也称为油菜素内酯[18]。农业生产上具有成本低、见效快、施用方便简单等优点[7]。可延缓作物叶片衰老，提高光合能力，增加叶绿素含量，促进蛋白质合成，提高含糖量，改善植物品质、增加产量。

逆境条件下生长的苜蓿，发育受阻、株高矮化、根系入土不深、全株生物量下降等。生物学指标能直接反映作物长势好坏，本研究喷施BR浓度为0.50‰BR可显著提高株高、根长、全株生物量。袁柱研究发现BR处理在一定程度上可促进苜蓿的生长发育，提高收获期株高，调控生长后期的营养生长和生殖生长，对不同生长阶段苜蓿叶片相对叶绿素含量均有影响[8]。廖莎研究发现水稻在低浓度喷施BR时，有明显促进根系生长的作用，促进出叶、出根、提高秧苗干物质量和壮秧指数[19]。

连作条件下苜蓿自身酶活性会发生改变。SOD，POD等抗氧化酶参与保护植株免受过量自由基伤害的过程，而酶活性的高低可反映植物在逆境中受伤害程度的大小[17]。MDA是植物过氧化的产物，其含量高低反映了植物抗逆性的强弱。可溶性糖是植物在生长发育中提供能量的物质，并维持一定的渗透压。植物依靠叶绿素来进行光合作用，把吸收的水和二氧化碳转变成植物需要的有机物质，叶绿素含量增加促进植物生长发育。本研究喷施浓度为0.50‰BR对POD，SOD，可溶性糖、脯氨酸均有显著影响，同时降低MDA含量。韩云研究发现芸苔素内酯各处理浓度能够显著增加小白菜的株高、叶宽、叶片数和生物量等产量指标，能够显著增加白菜的维生素C、可溶性糖和可溶性蛋白的含量[20]。万群研究发现用芸苔素内酯溶液处理樱桃五彩椒种子及幼苗，适宜浓度可提高五彩椒幼苗抗氧化酶SOD，POD，CAT的活性及脯氨酸含量、降低丙二醛含量，因此适宜浓度的芸苔素内酯可以促进樱桃五彩椒种子萌发，提高幼苗的抗低温能力[21]。

BR对植物生长发育有广泛的促进作用和独特的生理活性，植物对光的反应可能通过调控靶细胞中BR的信号转导途径、合成途径。与此同时多种植物激素间相互作用，相互影响，从而促进植物生长。虽然前人研究的BR喷施作物物种不同，地域不同，处理浓度会有差异性的表现，但本研究与前人研究结果一致，BR会促进植株生长，改善各项生理指标。本文施用不同浓度BR处理连作及非连作盆栽紫花苜蓿尚属首次，具体缓解或克服苜蓿连作障碍的机理尚不明晰，后期还需进行大田试验，进行更深层次的探讨。本试验结果为今后BR在苜蓿生产实践中广泛应用奠定理论基础。

4 结论

喷施BR能有效提高连作条件下紫花苜蓿株高、根长、全株生物量，显著提高了紫花苜蓿根、叶的过氧化物酶、超氧化物歧化酶活性，提高了根、叶的可溶性糖、脯氨酸、叶绿素含量，同时降低了丙二醛含量；喷施0.50‰浓度BR效果最好，0.25‰浓度次之。苜蓿生长发育表现良好，抗连作逆境效应明显，可达到理想的预期调控成效。