高效液相色谱法测定食用槟榔中三氯蔗糖含量的不确定度评定

陈雪梅 冯彦勇 肖 伟 杨玉娟 匡凤军 匡凤姣 郭旺青张 伟徐 凯

（1.湖南口味王集团有限责任公司，湖南 益阳 413001；2.湖南中益食品化工检测院，湖南 益阳 413001）

三氯蔗糖是我国批准广泛使用于各类食品中的甜味剂，甜味纯正,其甜度约为蔗糖的600倍，在食用槟榔中也有广泛的运用。根据《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》（GB 2760-2014）规定蜜饯凉果类（食用槟榔的食品添加剂参照蜜饯凉果类执行）最大使用量为1.5g/kg[2]。本文根据《测量不确定度评定与表示》（JJF1059.1－2012）[3]和《化学分析中不确定度的评估指南》（CNAS-GL006：2019）[4]建立模型，系统地分析不确定度来源，通过对影响样品检测结果的不确定度进行评定，提高检测结果的准确性。

一、实验部分

（一）实验原理

依据GB 22255-2014，试样中三氯蔗糖用甲醇水溶液提取，除蛋白、脂肪，经固相萃取柱净化后用液相色谱仪经反相色谱柱分离，根据保留时间定性，以峰面积进行定量。

（二）仪器设备

岛津高效液相色谱仪岛津RID-10A，定量重复性0.7%；梅特勒十万分之一电子分析天平XS105，精细量程0~41g，最小分度值0.00001g，0~50g示值误差为±0.00001g；A级移液管5mL，允差为±0.025mL；A级移液管50mL，允差为±0.05mL；A级容量瓶10mL，允差为±0.020mL；A级容量瓶100mL，允差为±0.10mL；KQ－2250B超声波清洗机，涡旋混合器，离心机；固相萃取柱（200mg，类型为N-乙烯基吡咯烷酮和二乙烯基苯亲水亲脂平衡型填料）使用前依次用4mL甲醇、4mL水活化。

（三）标准试剂

三氯蔗糖标准品（C12H19C13O8）:CAS编号56038-13-2，纯度≥99%，来源：Dr.Ehrenstorfer。

（四）测量步骤

1.标准溶液的制备

a.三氯蔗糖储备液（1.00mg/mL）:称取三氯蔗糖标准品0.10g(精确至0.0001g)于100mL容量瓶中，用水定容至刻度，混匀即得。

b.三氯蔗糖标准工作液：分别吸取0.5mL、1 mL、2 mL、5 mL、10 mL三氯蔗糖储备液于10 m L容量瓶中，用水定容至刻度。其中三氯蔗糖工作液浓度分别为 50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、500μg/mL、1000μg/mL。

2.色谱条件

色谱柱：C18（250mm×4.6mm×5μm）。流动相乙腈－水（11:89），柱温35℃，进样量为20μl。

3.样品处理

将槟榔粉碎，称取2.0g试样置于50mL离心管中，加5mL水超声提取30min后，加入15mL甲醇继续超声提取30min后以3000/r离心10min，将上清液移入分液漏斗内，沉淀物加入5.0mL甲醇水溶液（75+25），玻璃棒搅匀后，超声提取10min后以3000/r离心10min。重复提取2次，将上清液合并于分液漏斗内。在分液漏斗内加入30ml正己烷，振摇静置分层，下层水相移入50mL蒸发皿。蒸发皿于沸水浴上蒸发，当蒸发皿中的液体为1mL左右时用9mL水分三次冲洗蒸发皿，冲洗液合并移置于15mL离心管中，超声处理5min中，以3000/r离心10min。取全部上清液移入已经活化的固相萃取柱，控制液体流速不超过每秒1滴，柱上液面为2mm左右时加入1mL水，继续保持液体流速为每秒1滴，到柱中液体完全排除后，用3mL的甲醇洗脱，收集洗脱液。将洗脱液置于50mL蒸发皿内，于沸水浴上蒸干，残渣用50.0mL乙腈水溶液（11+89）溶解，溶液过0.45μm滤膜，滤液为制备试样溶液，备用。测定：取标准工作液和试样各20μL注入液相色谱仪进行分析，以保留时间定性，峰面积外标法定量。

二、测量不确定度的评定

（一）建立数学模型

试样中三氯蔗糖含量计算公式如下：

式中：X为试样中某组分的含量，单位为克每千克（g/kg）；C为由标准曲线上求得进样液中某组分的浓度，单位为微克每毫升（ug/mL）；V为试样溶液体积，单位为毫升（mL）；m为试样的质量，单位为克（g）。

（二）测量不定度来源分析

从测量过程和计算公式考量，三氯蔗糖含量测定的不确定度来源主要有以下几方面[5]：①标准物质②标准曲线的拟合③回收率④仪器的响应值⑤测量样品处理操作过程的差异⑥样品峰面积的测量。

每一个考量的来源又分别受不同因素的影响，其可归纳为以下几方面。

1.样品定容时的总体积V带入的不确定度

主要有容量瓶校准的不确定度和温度变化产生的不确定度。

2.样品容液中三氯蔗糖含量浓度的不确定度

（1）标准溶液的浓度-峰面积拟合校准曲线求得C时产生的不确定度。

（2）配制标准工作液带入的不确定度。

主要包括[5]：a.标准物质引入的不确定度；b.称量产生的不确定度；c.标准工作液配制过程量器校准产生的不确定度；d.温度变化对标准工作液配制时产生的影响。

（3）样品液峰面积测量的不确定度

由两方面带入：①峰面积重复性测量带入；②数据处理系统带入。

（三）样品称量过程中引入的不确定度

（四）样品本身特性和处理过程f freprep带入的不确定度

（五）样品在萃取时带来的不确定度，用回收率来考量

三、不确定度分量的评定

（一）样品定容时的总体积V V带入的不确定度

1.容量瓶校准时产生的不确定度

样品处理过程中需要用到50.0ml天玻A级胖度移液管，按照《常用玻璃量具检定规程JJG 196-2006》的要求，其相应的最大允差±0.05，用其矩形分布考虑，k=

u1=Δy/k=0.05/3=2.88×10-2

u1rel=2.88×10-2/50=5.77×10-4

2.温度变化带入的不确定度考量

在分析测试中，测量过程中的温度也对其有影响，我们以做样过程时的温度25℃进行考量，以量瓶的校准温度20℃进行考量，水的膨胀系数为2.1×10-4ml/℃，温度变化是矩形分布，标准不确定度为：

相对标准不确定度：u2rel=0.03/50=0.0006

（二）样品容液中三氯蔗糖含量浓度的不确定度

1.标准溶液的浓度-峰面积拟合校准曲线求得C时产生的不确定度

校准曲线拟合的标准不确定度是通过对标准系列进行两次重复测定，测得其峰面积，测定结果见表1。

表1 校准曲线拟合数据

由实验数据[5]用最小二乘法拟合可得标准曲线，其拟合校准曲线参数的标准不确定度可以利用统计程序计算获得，根据测量数据用线性回归方程y=a+bx求出校准曲线，由最小二乘法得到拟合直线的斜率b和截距a分别为：

三氯蔗糖峰面积的标准偏差S为：

应用该曲线进行测量时，对被测样品溶液测量两次，n=10，测得待测液中三氯蔗糖的含量测定值为1.563ug；则校准曲线的拟合的标准不确定度u(ure)

相对标准不确定度三氯蔗糖urel(ure)=u(ure)/C=0.206

表3 温度变化引起的标淮溶液系列配制过程中的不确定度

2.配制标准工作液带入的不确定度

（1）标准物质引入的不确定度评定

标准物质引入的一般为B类评定，查看三氯蔗糖标准物质证书提供的信息，不确定度是±1.0%。标准物质给出的一般是扩展不确定度，属于正态分布，置信水平为95%，包含因子k=2，其相对不确定度为：

（2）称量标准物质时产生的相对标准不确定度

标准物质的称样量为：0.100g，用十万分之一天平称量样品，校准证书给出天平的重复性误差为0.0000g，天平的示值误差为±0.00001g，两次称量获得结果，按均匀分布（矩形分布）考虑，

则：标准不确定度：

相对标准不确定度：

（3）标准工作液配置过程中量器具校准产生的不确定度评定

标准工作液制备过程需要使用几种规格的玻璃量具，按照《常用玻璃量具检定规程JJG-2006》的要求，均有相应的最大允差，按照矩形分布考虑，k=，由此来估算相对不确定度分量（见表2）。

表2 标淮溶液配制过程中玻璃量具引起的标准不确定度

由表2数据合成的相对标准不确定度：

（4）温度变化对标准工作液配制时产生的影响[5]

由于温度缺乏控制而产生不确定度。根据制造商提供的信息，该量具已在20℃校准，而实验室的温度在±5℃之间变动，该影响引起的不确定度可以通过估算温度范围和体积膨胀系数来进行计算，液体的体积膨胀明显大于玻璃的体积膨胀，因此，只需要考虑前者即可。水的膨胀系数为2.1×10-4ml/℃，计算标准不确定度时假设温度变化是矩形分布。

由表3得到的相对标准不确定度为：

（5）合成标准不确定度

由（1）、（2）、（3）、（4）合成的相对标准不确定度为：

3.样品液峰面积测量的不确定度

（1）峰面积重复性测量产生的不确定度

通过对试样液重复进样6次进行评定，进样6次峰面积分别为 5138.0、5091.8、5109.8、5031.4、5162.6、5098.5。根据数据进行计算。由于测量次数少，根据JJF1059.1-2012-贝塞尔公式法，采用极差法进行评定。

标准不确定度：

相对标准不确定度：

（2）数据处理系统引入的不确定度[5]

根据仪器说明书和积分仪的一般性能指标分析，目前用于液相色谱仪峰面积积分处理的最大误差为0.2%～1%，取1%，属于B类评定，则峰面积的相对不确定度为：

（3）试样处理液峰面积测量的不确定度的合成

由u1rel和u2rel合成试样处理液峰面积测量的相对标准不确定度为：

则由以上分量合并待测样液中三氯蔗糖含量测定值C的不确定度为：

（三）样品称量过程引入的不确定度

样品称量为5.0g，按JJG2053-2006《质量的计量器具检定系统》所给出的质量允许差Δy=1.0mg,其置信水平P=99%，属于正态分布，包含因子k=3。

不确定度为：

相对标准不确定度：

（四）样品本身特性和处理过程f freprep带入的不确定度

检测结果的复现性主要受操作人员在样品处理过程的手法影响，样品的特性和每台仪器本身的性能因素影响，属A类不确定度评定，采用同一样品进行重复实验进行评估。其重复实验结果见表4。

表4 重复性实验结果

单次测量结果的标准偏差：

标准不确定：

相对不确定度：

（五）回收率及其不确定度评定u ur r(Rec)(Rec)

液相色谱法测定使用槟榔中的三氯蔗糖样品需经过超声、定容、萃取、浓缩等步骤。在这一冗长的过程中，每一个步骤的操作都会带入不确定度。要逐步确定其对测量结果不确定度的贡献是相当困难的，可采用检测方法制定过程中的有关数据，如回收率等进行统一评定（见表5）。

表5 回收率测定结果

平均回收率为80.8%，标准偏差s为1.18%。回收率相对标准不确定度：

三、槟榔中三氯蔗糖含量测定标准不确定度的合成

根据上述不确定度分量分析，合成标准不确定度为（见表6）：

表6 不确定度分量及其相对不确定度

在不考虑各输入量之间的相关性的情况下，以方和根合成标准不确定度，

合成标准不确定度为：

四、测量不确定度的报告

将合成不确定度乘以给定概率的包含因子k就得到扩展不确定度，在置信概率取95%的情况下，包含因子k=2，则相对扩展不确定度为U（X）=k×Urel（X），k=2，即U=0.020736×2=0.041472g/kg。

待测槟榔样中三氯蔗糖的含量为X1=0.81g/kg；综上所述，在报告利用高效液相色谱法测定槟榔中三氯蔗糖含量的测定结果时给出不确定度值，结果表示如下：

X（三氯蔗糖）=X±U（X），k=2

即 X（三氯蔗糖）=（0.81±0.041472）g/kg。

五、结论

依据GB 22255-2014《食品安全国家标准食品中三氯蔗糖（蔗糖素）的测定》方法，通过对整个实验中产生不确定度的分量进行比较发现，由最小二乘法进行标准曲线的拟合计算待测样品的浓度对结果的不确定度影响最大，因此为了减小测量误差，应该选择合适的标准溶液浓度范围，并保证待测液含量在标准曲线的中间位置来减少因标准曲线带来的不确定度，提高测量结果的准确度。