耐甲氧西林金黄色葡萄球菌杀白细胞素基因检测

赖奋强，郭庆昕，杨 滨，郑韵芳

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistantStaphylococcusaureus, MRSA)是全世界范围内的主要公共卫生问题，在美国每年因MRSA感染所致的死亡人数高于艾滋病[1]。这是由于社区获得性MRSA(Community-acquired methicillin-resistant Staphylococcus aureus，CA-MRSA)的发展所致，也是急诊科中皮肤和软组织感染的主要原因[2]。然而，分子特征决定CA-MRSA菌株在医院外传播和感染健康人群的能力仍然很差[3]。细胞溶解肽，α-型苯酚可溶蛋白(Phenol-soluble modulinsα，PSMα)和α-毒素(α-toxin，hla)对CA-MRSA疾病的进展起决定性作用[4-5]，这两种毒力因子并非专门出现在CA-MRSA中，基因表达的差异可部分解释CA-MRSA菌株增强毒力的原因[4]。值得注意的是许多CA-MRSA菌株携带有编码杀白细胞素(Panton-Valentine leukocidin，PVL)的lukSF-PVL基因，而其他菌株中lukSF-PVL较少[3]，因此，PVL已被认为是导致CA-MRSA毒力增加的主要因素之一[6]。

1 材料与方法

1.1菌株来源 83株分离菌来自于某综合三甲医院临床各科室送检的痰、血液、伤口分泌物、耳道分泌物、尿液、脓液、无菌体液等标本，经临床微生物室分离鉴定的非重复MRSA菌株；按美国疾病预防控制中心(CDC)的CA-MRSA 定义为：患者在门诊或入院48 h之内分离到MRSA菌株；1年内无住院或与医疗机构接触史； 没有留置各种导管及其他穿透皮肤的医用装置[3]，将临床分离的MRSA菌株分成医院获得性MRSA(HA-MRSA)组与CA-MRSA组。金黄色葡萄球菌质控菌株ATCC29213为福建医科大学附属第一医院微生物室保存；SCCmec分型标准菌株为同济大学附属上海肺科医院余方友教授馈赠。

1.2 仪器与试剂

1.2.1主要仪器 Vitek-2全自动细菌检测系统购于法国生物梅里埃有限公司，恒温培养箱购于上海跃进医疗器械有限公司，PCR仪购于Eppendorf有限公司，电泳仪购于北京六一仪器厂，凝胶成像仪购于上海山富科学仪器有限公司，台式高速离心机购于北京时代北利离心机有限公司。

1.2.2主要试剂 血琼脂平板、革兰阳性菌鉴定卡GP、革兰阳性菌药敏卡GP67均购于法国生物梅里埃有限公司，溶菌酶缓冲液、溶菌酶、细菌基因组提取试剂盒均购于上海生工生物工程公司，PCR反应 10×Buffer、dNTP、6×Loading Buffer、100 bp DNA Ladder Marker、rTaq DNA聚合酶购于大连宝生TaKaRa有限公司，PCR引物由上海生工生物工程公司合成

1.3 研究方法

1.3.1基因组提取 取培养过夜的金黄色葡萄球菌单个菌落1个，接种于灭菌脑心浸液肉汤中，36 ℃培养过夜。取 1 mL 过夜培养的细菌菌液，加入 1.5 mL 离心管中，室温 8 000 r/min 离心 1 min，弃上清，收集菌体，加入 180 μL的溶菌酶溶液重悬菌液，37 ℃水浴 60 min，其余步骤按细菌基因组提取试剂盒说明书进行。得到的DNA用50～100 μL TE缓冲液溶解并立即-20 ℃保存。

1.3.2SCCmec分型 扩增引物和实验方法参照文献[7]，结果判读以Marker为基准，结合SCCmec标准菌株在相应位置出现荧光条带为阳性。

1.3.3spa分型 扩增引物和实验方法参照文献[8]，将PCR产物送上海生工生物工程有限公司单向测序，观察测序结果峰图，确认序列的质量。spa基因24 bp重复序列区域的两端是相对保守的，其5′端的标志序列RCA MCA AAA(与重复序列的5′端起始相距0 bp),3′端的标志序列为TAY ATG TCG T(与重复序列的3′端末尾相距19 bp或18 bp)。按照上述规则截取重复序列区域，并按照24 bp分割成不同的重复单元(repeats)，登陆官方网站http://spa.ridom.de/spatypes，查询各菌株的spa分型。

1.3.4PVL基因检测 扩增引物和实验方法参照相关文献[9]，选取部分扩增产物送上海生工生物工程有限公司进行测序确认。

1.4统计学方法 采用SPSS 19.0软件进行统计学分析，计数资料数据采用百分比(%)表示，χ2检验；分类计数资料总例数n≤40或T<1时，采用Fisher确切概率法(Fisher exact probability test)；以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1送检科室分布 83株MRSA中18(21.7%)株来自于耳鼻喉科，16(19.3%)株来自于皮肤科，9(10.8%)株来自于血管外科，6(7.2%)株来自于骨科，5(6.0%)株来自于呼吸内科，5(6.0%)株来自于儿科，4(4.8%)株来自于重症医学科。39株HA-MRSA中5(12.8%)株来自于骨科，4(10.3%)株来自于耳鼻喉科，4(10.3%)株来自于呼吸内科，4(10.3%)株来自于重症医学科；44株CA-MRSA中15(34.1%)株来自于皮肤科，14(31.8%)株来自于耳鼻喉科，6(13.6%)株来自于血管外科，4(9.1%)株来自于儿科，详见表1。

表1 83株MRSA送检科室分布
Tab.1 Departments distribution of the 83 MRSA delivered

送检科室MRSA/%n=83HA-MRSA/%n=39CA-MRSA/%n=44耳鼻喉科18(21.7)4(10.3)14(31.8)皮肤科16(19.3)1(2.6)15(34.1)血管外科9(10.8)3(7.7)6(13.6)骨科6(7.2)5(12.8)1(2.3)呼吸内科5(6.0)4(10.3)1(2.3)儿科5(6.0)1(2.6)4(9.1)重症医学科4(4.8)4(10.3)0(0.0)其他科室20(24.1)17(43.6)3(6.8)

注：其他科室包括肝胆胰外科、神经外科各3株，干部病房、神经内科、胃肠外科、胸外科、眼科各2株，甲状腺科、康复科、泌尿科、内分泌科各1株。

2.2基因分型结果 83株MRSA中HA-MRSA39株，CA-MRSA44株；SCCmec分型检出4个分型，SCCmecⅠ1株(1.2%)SCCmecⅡ3株(3.6%)SCCmecⅢ54株(65.1%)SCCmecⅣa24株(28.9%)；39株HA-MRSA中SCCmecⅠ1株(2.6%)SCCmecⅡ3株(2.7%)SCCmecⅢ32株(82.1%)SCCmecⅣa2株(5.1%)未知分型1株(2.6%)；44株CA-MRSA中SCCmecⅢ22株(50.0%)SCCmecⅣa22株(50.0%)。spa分型中83株MRSA共检出15个型，主要分型为t437共33(39.8%)株，t062共18(21.7%)株,t015共9(10.8%)株；HA-MRSA 的主要spa分型t437为11(28.2%)株，t062为 9(23.1%)株，t015为4(10.3%)株，t030为4(10.3%)株；CA-MRSA 中t437为22(50.0%)株，t062为9(20.5%)株，t015为 5(11.4%)株。

2.3PVL基因检测结果 PVL总阳性率24.3%(20/83)，HA-MRSA阳性率10.3%(4/39)，4株PVL阳性的菌株全部为SCCmecⅢ，CA-MRSA阳性36.4%(16/44)，12株PVL阳性为SCCmecⅣa，4株PVL阳性为SCCmecⅢ，在PVL阳性率上HA-MRSA与CA-MRSA比较(图2)，P=0.006，差异有统计学意义。部分菌株PVL凝胶电泳图见图1。

1: 100 bp DNAmarker; 2-4: PVL positive samples; 5-6: PVL negative samples图1 部分菌株PVL凝胶电泳图Fig.1 Gel electrophoresis of PVL

33株spat437中有18株携带PVL基因，阳性率54.5%，50株其他spa分型中仅2株携带PVL基因，阳性率4.0%，两组比较(图3)P=0.000，差异有统计学意义。

图2 HA-MRSA与CA-MRSA PVL携带率比较Fig.2 Comparison of PVL between HA-MRSA and CA-MRSA

2.4PVL基因阳性的MRSA特征 9株为CA-MRSA-Ⅳa-t437， 4株为HA-MRSA-Ⅲ-t437，3株为HA-MRSA-Ⅳa-t437， 2株为CA-MRSA-Ⅲ-t437，CA-MRSA-Ⅲ-t015 和CA-MRSA-Ⅲ-t062各 1株；20株PVL基因阳性的MRSA中10株分离自皮肤软组织感染病例，6株分离于耳鼻喉科感染病例，3株分离于呼吸道感染病例，1株分离于败血症病例，详见表2。

表2 PVL基因阳性的MRSA特征
Tab.2 Characteristics of PVL gene positive MRSA

科室临床诊断标本类型MRSA类型SCCmec分型spa分型小儿外科颌下腺脓肿脓液CAⅣat437整形外科皮肤慢性溃疡分泌物HAⅣat437眼科泪囊炎分泌物CAⅣat437耳鼻喉科中耳炎分泌物CAⅣat437血管外科肺栓塞痰HAⅢt437重症医学科小脑出血痰HAⅢt437耳鼻喉科慢性鼻窦炎分泌物CAⅣat437血管外科左下肢肿胀分泌物HAⅣat437皮肤科蕈样肉芽肿分泌物HAⅣat437甲状腺科甲状腺肿物分泌物HAⅢt437皮肤科多形红斑分泌物CAⅣat437重症医学科头颈外伤痰HAⅢt437儿科败血症血液CAⅣat437耳鼻喉科外耳炎分泌物CAⅣat437小儿外科乳腺脓肿脓液CAⅢt437神经外科神经纤维瘤分泌物CAⅣat437耳鼻喉科外耳炎分泌物CAⅢt437耳鼻喉科化脓性中耳炎分泌物CAⅣat437皮肤科特应性皮炎分泌物CAⅢt015小儿外科颈部脓肿脓液CAⅢt062

图3 spat437与其他spa分型PVL携带率比较Fig.3 Comparison of PVL between t437 and other spa type

3 讨 论

金黄色葡萄球菌的毒力包括为各种酶、毒素、侵袭力、表面蛋白等，根据基因编码位置的不同可以分为两大类，一类是编码在可移动元件(MGE)上的毒力包括各种类型的超抗原如中毒性休克综合征毒素、肠毒素，杀白细胞素(PVL)和剥脱性毒素，另一类是金黄色葡萄球菌的固有毒力，如α-毒素，β-毒素，酚可溶性调节肽(PSM)，几乎所有菌株均携带，但是不同毒素基因的表达水平不同可表现出不同致病性。

CA-MRSA较 HA-MRSA具有更强的毒力已成为近年来MRSA毒力水平研究的热点， CA-MRSA菌株显示出相当大的逃避中性粒细胞吞噬的能力，并且已逐渐成为常识。微生物学专家就CA-MRSA毒力增加的原因提出两种假说来解释，一个是CA-MRSA从MGE中获得PVL[10]；另一个是CA-MRSA促进核心基因组编码的毒力基因的表达，如PSMα、hla等[11]；但这两个假说相互之间并无冲突，可以一起来增加CA-MRSA的毒力。

本研究中83株MRSA的PVL阳性率为24.1%，CA-MRSA(36.4%)>HA-MRSA(10.3%)，结果显示CA-MRSA菌株更容易携带PVL基因。PVL是葡萄球菌杀白细胞的双组分家族的成员，由原噬菌体编码的两个相邻lukS和lukF基因编码，其产生两种毒素部分(LukS和LukF)，两者都是细胞溶解活性所必需的成分。在CA-MRSA流行的初期，PVL基因lukS和lukF几乎被发现于所有CA-MRSA克隆中，而PVL通常不存在于HA-MRSA中[10]。在动物感染模型中与同基因的PVL阴性变异体相比，含有PVL的CA-MRSA显示明显增加的发病率和死亡率，表明PVL在严重CA-MRSA相关性疾病的发展中的重要作用，PVL对发病机制的贡献可认为其能溶解中性粒细胞的作用相关联[12]，同时PVL阳性菌株高表达spa，增加了PVL对中性粒细胞和巨噬细胞的裂解能力，增加炎症介质的释放，导致组织炎症和坏死[13]。而核心基因组编码的毒力PSMα在CA-MRSA菌株的皮肤感染模型中的毒力起相当大的作用，虽然PSM基因存在于所有金黄色葡萄球菌中，但CA-MRSA菌株较HA-MRSA菌株产生更多的PSM[11]。此外，α-毒素则可以显著影响皮肤和肺部感染模型中的CA-MRSA毒力，虽然对人中性粒细胞不溶细胞，但α-毒素裂解一系列其他细胞，例如红细胞和巨噬细胞，并且有助于破坏上皮屏障[14]。agr调控系统作为金黄色葡萄球菌毒力基因全局调控的重要开关，调控包括PSMα、α-毒素、δ-毒素和其他的毒力决定簇的高表达，在CA-MRSA高毒力中发挥重要的作用，同时PVL基因的高表达干扰了agr调控系统，也可能增强CA-MRSA毒性[15]。

从分子流行学特征出发，本研究中20株PVL阳性的MRSA中，18株为spat437型，占90.0%，其中CA-MRSA-Ⅳa-t437共9株，占45.0%，同时spat437型也是本研究的主要基因型，CA-MRSA(50.0%)和HA-MRSA(28.2%)，该型是我国健康人群中携带率最高的MRSA基因型[16]，在spaRIDOM 官方网(http://www.spaserver.ridom.de)上排名第17位，频率为0.73%，共有2 890株(2018年2月)。研究发现spat437型的克隆绝大部分属于ST59型[17-18]，该克隆是我国南方、邻近亚洲国家及部分欧洲国家最常见的CA-MRSA菌株[19-20]。值得注意的是本研究中有7株HA-MRSA的PVL基因阳性，SCCmec分型中4株为Ⅲ，3株为Ⅳa，提示携带有更高毒力的CA-MRSA克隆已经播散到医院环境中引起医院获得性相关感染如肺炎和手术切口感染。近年来国内外相关研究发现有10%～80%的院内感染菌株具有CA-MRSA的分子特征[21]，虽然CA-MRSA进入院内并取代经典的HA-MRSA菌株的争议目前尚无定论，但是有学者认为CA-MRSA通常携带较小的SCCmecⅣ型和SCCmecⅤ型的元件，更便捷的转移性，更强的适应性，更容易在不同遗传背景中的菌株中转移[22]，因此推断在医院获得性相关感染中CA-MRSA克隆与HA-MRSA克隆将会共存。

利益冲突：无