梅花鹿茸血冻干粉的安全性评价及缓解体力疲劳功能研究

秦 珩 李世芬 胡 奇 环 飞

(1. 南京医科大学公共卫生学院，江苏 南京 211166；2. 江苏省医药农药兽药安全性评价与研究中心，江苏 南京 211166)

鹿茸为梅花鹿或马鹿的雄鹿未骨化而带茸毛的幼角，为传统中药材，富含多肽、脂肪酸、氨基酸、多糖等营养物质，其中氨基酸成分占总成分的50%以上[1]。研究者[2]在鹿茸中发现了多种细胞生长因子，诸如胰岛素样生长因子、神经生长因子、鹿茸多肽等。其中鹿茸多肽可明显加速骨组织的再生以及创面的愈合[3]，能够促进神经细胞损伤修复[4]，改善认知功能障碍[5]。鹿茸不同部位的水提液对细胞的增殖有促进作用，并且呈现明显的浓度依赖效应[6]。鹿茸血为采割马鹿或梅花鹿茸后用真空泵或者分离机从鹿茸中提取出来的血液，其营养成分较多，尤其是钾、钙、镁、铁、锌含量较高，其中钙、铁、锌含量明显高于鹿茸中的含量[7]，因此鹿茸血的营养要高于鹿茸。鹿茸血中营养成分高主要是由于血液是供给机体营养的运送源，血液含有22种无机元素，18种氨基酸[8]，因此鹿茸血同样含有多样营养元素[9]，且具有缓解骨质疏松[10]，减轻免疫耐受性，限制移植瘤增长速度的功效[11]。但关于鹿茸血安全性的评价未见报道。试验拟通过小鼠急性毒性试验、30 d喂养试验、小鼠三项遗传毒性试验等对梅花鹿茸血冻干粉的安全性进行评价，并依据卫生部《保健食品检验与评价技术规范》[12]的规定对梅花鹿茸血缓解小鼠体力疲劳功能进行研究，以期为鹿茸血的安全性及缓解体力疲劳作用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 受试样品

梅花鹿茸血冻干粉：南京中科药业有限公司。

1.1.2 主要试剂

鼠伤寒沙门氏菌突变型菌株TA97、TA98、TA100、TA102：Molecular Toxicology, Inc.；

S-9(大鼠肝匀浆S-9)：江苏齐氏生物科技有限公司；

血浆尿素测定试剂盒、肝糖原测定试剂盒：南京建成生物工程研究所。

1.1.3 试验动物

急性毒性试验选用的小鼠：生产许可证号SCXK(苏)2016-0002，合格证编号201603830，南京医科大学医药实验动物中心；

30 d喂养试验与缓解体力疲劳试验选用SPF级健康离乳SD大鼠及SPF级CI/F1代健康雄性小鼠：生产许可证号SCXK(沪)2013-0016，合格证编号2008001662204、2008001664130，上海西普尔—必凯实验动物有限公司；

小鼠微核试验及精子畸形试验的小鼠：生产许可证号SCXK(苏)2012-0004，合格证编号201605533、201604137，扬州大学比较医学中心。

1.1.4 仪器与设备

电子天平：T-1000型，常熟市双杰测试厂；

电热培养箱：DNP-9162BS型，上海新苗医疗器械制造有限公司；

多功能酶标仪：Spectra Max M2e型，美国Molecular Devices公司；

全自动生化分析仪：7100型，日立高新技术(上海)国际贸易有限公司；

血液分析仪：ADVIA 2120i型，德国Siemens公司。

1.2 方法

1.2.1 小鼠急性经口毒性试验(最大耐受量法) 20只SPF级ICR健康成年小鼠，雌雄各半，体重为18.9～21.8 g。给样前禁食16 h。直接用无菌水配制梅花鹿茸血冻干粉，最大可配制浓度为0.375 g/mL，按最大灌胃量20 mL/(kg·BW)分两次给样，每次间隔4 h，剂量为15.000 g/(kg·BW)。给样后观察并记录是否有中毒表现及死亡情况，连续14 d。

1.2.2 Ames试验 在有代谢活化和无代谢活化条件下采用平板掺入法。选取经鉴定合格的鼠伤寒沙门氏菌突变型菌株TA97、TA98、TA100 和 TA102。β-萘黄酮和苯巴比妥钠诱导的大鼠肝S-9作为活化系统，其蛋白含量为30 mg/mL。设自发回变组(阴性对照)，溶剂对照组(溶剂为二甲亚砜，0.1 mL/皿)，阳性对照组：不加S-9的活化系统中所用的阳性物为2,4,7-三硝基芴铜0.2 μg/皿(TA97、TA98)和甲基磺酸甲酯1.0 μL/皿(TA100、TA102)，加S-9的活化系统中所用的阳性物为2-氨基芴10 μg/皿(TA97、TA98、TA100)和1,8-二羟基蒽醌50 μg/皿(TA102)。梅花鹿茸血冻干粉5 000，1 000，200，40，8 μg/皿剂量进行试验，分别在加与不加S-9的情况下每个剂量组做3个平行。如果受试样品组的回变菌落数达到阴性对照组回变菌落数2倍及以上，并有剂量—反应关系则该试验结果为阳性。

1.2.3 小鼠骨髓细胞微核试验 梅花鹿茸血冻干粉试验组为1 875，3 750，7 500 mg/(kg·BW) 3个剂量，阴性对照组以无菌水代替，以20 mL/(kg·BW)进行灌胃，阳性对照组腹腔注射环磷酰胺[40 mg/(kg·BW)]。采用30 h 进样法，两次进样间隔24 h。第2次给样6 h后，处死动物制片。显微镜下计数含微核的嗜多染红细胞数，并计算微核率。每只大鼠计数200个嗜多染红细胞时所观察到的成熟红细胞数(NCE)，并计算嗜多染红细胞与成熟红细胞的比例(PCE/NCE)。

1.2.4 小鼠精子畸形试验 梅花鹿茸血冻干粉试验组为1 875，3 750，7 500 mg/(kg·BW) 3个剂量，阴性对照组以无菌水代替，以20 mL/(kg·BW)进行灌胃，阳性对照组腹腔注射环磷酰胺[40 mg/(kg·BW)]。每天给样1次，连续进行5 d。动物在第一次给样后的第35天被处死，取两侧附睾的精子滤液进行制片。显微镜下计数1 000个结构完整的精子，记录其中精子畸形的类型和数量，计算精子畸形率。

1.2.5 30 d喂养试验 将80只SPF级健康断奶SD大鼠按体重随机分为4组，雌雄各半。通过逐步稀释样品的方法将梅花鹿茸血冻干粉掺入基础饲料中，按体重的10%折算。梅花鹿茸血冻干粉以0.6，1.3，2.0 g/(kg·BW·d)3个剂量掺入基础饲料的百分含量分别为0.6%，1.3%，2.0%，连续喂养30 d后采集血样进行常规血液检查、生化检查，同时进行大体解剖和组织病理学检查。

1.2.6 缓解体力疲劳作用 选用SPF级CI/F1代健康雄性小鼠160只，按体重随机分为4个组，每组40只，以梅花鹿茸血冻干粉0.1，0.2，0.6 g/(kg·BW·d)的剂量，小鼠每天灌胃1次，阴性对照组给予相同体积的溶剂，灌胃量为0.1 mL/(10 g·BW)，持续30 d。

(1) 第1组小鼠在最后一次给样30 min后，每只小鼠尾根部负重5%体重的铅丝，置于游泳箱中游泳。以小鼠游泳开始至死亡时间作为负重游泳时间。

(2) 第2组小鼠在最后一次给样30 min后，置于游泳箱中不负重游泳90 min，休息60 min后立即眼眶采血。血液离心后，吸取20 μL血浆，用二乙酰—肟法测定血浆尿素值。

(3) 第3组小鼠在最后一次给样30 min后，立即处死，取肝脏经生理盐水漂洗后用滤纸吸干，精确称取肝脏配制成1%肝匀浆液，取1%肝匀浆液0.1 mL，加2 mL蒽酮试剂，煮沸5 min，冷却后在620 nm波长比色测定，根据所称取的肝脏重量计算肝糖原含量。

(4) 第4组小鼠在最后一次给样30 min后眼眶采血。然后于游泳箱中不负重游泳10 min后捞起，再次眼眶采血，休息20 min后第3次采血，用血乳酸分析仪测定各时点血乳酸含量，并计算血乳酸曲线下面积。

血乳酸曲线下面积按式(1)计算。

S=1/2×[(OD1+OD2)×10+(OD2+OD3)×20]，

(1)

式中：

S——血乳酸曲线下面积；

OD1——游泳前血乳酸值，mmol/L；

OD2——游泳10 min后的血乳酸值，mmol/L；

OD3——休息20 min后的血乳酸值，mmol/L。

1.3 数据分析

采用SPSS 22.0软件对各组原始数据进行分析。对满足均匀方差要求的数据用单因素方差分析方法中多个试验组与一个对照组间均数的两两比较方法进行统计处理。采用秩和检验法处理方差不齐的数据资料，P<0.05为差异显著。用泊松分布U检验法对骨髓细胞微核试验结果进行统计分析，采用秩和检验法对小鼠精子畸形结果进行分析。

2 结果与分析

2.1 小鼠急性毒性试验

由表1可见，在观察期内未见有动物死亡，且梅花鹿茸血冻干粉对小鼠体重无明显影响。梅花鹿茸血冻干粉小鼠急性经口毒性剂量>15 g/(kg·BW)，样品为无毒级。根据《保健食品检验与评价技术规范》(2003年版)中关于急性毒性剂量分级标准，梅花鹿茸血冻干粉属于无毒级。

表1 小鼠急性经口毒性Table 1 Acute oral toxicity in mice (n=10)

2.2 Ames试验

由表2可见，梅花鹿茸血冻干粉各剂量组回变菌落数均不超过阴性对照组的2倍，且不存在明显的剂量反应关系。因此认为在加与不加S-9时梅花鹿茸血冻干粉对鼠伤寒沙门氏菌TA97、TA98、TA100、TA102 4株试验菌株无致基因突变作用。

2.3 小鼠骨髓细胞微核试验

由表3可见，梅花鹿茸血冻干粉各剂量组微核率与阴性对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)，但阳性对照组微核率显著高于阴性对照组且差异有统计学意义(P<0.01)。梅花鹿茸血冻干粉各剂量组PCE/NCE比值小于阴性对照组的20%，对骨髓细胞增殖无抑制作用。

2.4 小鼠精子畸形试验

由表4、5可见，梅花鹿茸血冻干粉不同剂量组精子畸形率与阴性对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)，阳性对照组精子畸形率明显高于阴性对照组且差异有统计学意义(P<0.01)。因此梅花鹿茸血冻干粉的小鼠精子畸形试验结果为阴性。

2.5 大鼠30 d喂养试验

由表6～8可见，梅花鹿茸血冻干粉在连续喂饲大鼠30 d后，对雌、雄性大鼠各观察点的体重无明显影响，对各剂量组大鼠的的血液及生化指标均未产生明显影响。梅花鹿茸血冻干粉高剂量组和阴性对照组大鼠的肝、肾、脾、胃、十二指肠、卵巢、睾丸进行了组织病理学检查，如图1所示，高剂量组的大鼠脏器未见有明显的组织病理学改变。

2.6 小鼠负重游泳时间、运动后血清尿素水平、肝糖原储备量及血乳酸曲线下面积

小鼠负重游泳时间的长短能反映小鼠的耐力情况[13]，由表9可见，梅花鹿茸血冻干粉0.60 g/(kg·BW·d)组的小鼠负重游泳时间明显长于阴性对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。说明梅花鹿茸血冻干粉具有增进体能，增强耐力的作用。各剂量组小鼠运动后的血清尿素水平与阴性对照组比较，无明显差异。梅花鹿茸血冻干粉0.10，0.20，0.60 g/(kg·BW·d)剂量的肝糖原储备量高于阴性对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。肝糖原是由许多葡萄糖分子聚合而成的物质，当机体需要时，便可分解成葡萄糖，转化为能量[14]。研究结果表明鹿茸血可增加肝糖原的储备量，为机体提供更多的能量，减少剧烈体力运动后糖原的消耗，起到缓解体力疲劳的作用。血液中的乳酸浓度在强烈运动时会急剧上升，体内的乳酸来不及处理，造成乳酸的堆积[15]，鹿茸血冻干粉0.60 g/(kg·BW·d)组的小鼠游泳前后血乳酸曲线下面积值小于阴性对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。说明梅花鹿茸血冻干粉能增加有氧代谢能力，促进乳酸代谢，降低血液中乳酸浓度，使乳酸能更快速地转化为肌肉收缩所需的能量，缓解运动后疲劳感，与白晨等[16]的研究结果一致。

表2 Ames试验回变菌落数† Table 2 Ames test retrograde colony count (n=3)

† **超过阴性对照组菌落数2倍以上。

表3小鼠骨髓细胞微核发生率和嗜多染红细胞与成熟红细胞比值†

Table3Incidenceofmicronucleusinbonemarrowcellsandratioofpolychromaticerythrocytetomatureerythrocyteinmice(PCE/NCE) (n=5)

性别剂量/(mg·kg-1·BW)PCE数含微核的PCE数微核率/‰PCE/NCE雌阴性对照5 00061.2±0.81.06±0.061 8755 00091.8±0.81.05±0.073 7505 00061.2±0.81.09±0.057 5005 00081.6±1.31.08±0.03阳性对照5 00010320.6±2.4∗∗0.91±0.05雄阴性对照5 00010 2.0±1.21.08±0.051 8755 00081.6±1.11.04±0.053 7505 00071.4±0.51.05±0.087 5005 00071.4±1.11.08±0.05阳性对照5 00011422.8±4.1∗∗0.92±0.05

† **与阴性对照组比较(P<0.01)。

表4 小鼠精子畸形率†Table 4 Rate of sperm abnormality in mice (n=5)

† **与阴性对照组比较，P<0.01。

表5 小鼠精子畸形类型及比例†Table 5 Types and proportions of sperm abnormalities in mice

† 占比为该类畸形数量占总畸形数量的百分比。

表6 大鼠体重Table 6 Weight of rats (n=10)

表7 大鼠血液学指标Table 7 Hematological indices in rats (n=10)

图1 组织病理学图片Figure 1 Histopathological picture

性别剂量/(g·kg-1·BW)谷丙转氨酶/(U·L-1)谷草转氨酶/(U·L-1)总蛋白/(g·L-1)白蛋白/(g·L-1)尿素氮/(mmol·L-1)肌酐/(μmol·L-1)总胆固醇/(mmol·L-1)甘油三酯/(mmol·L-1)血糖/(mmol·L-1)雌0.033±6130±3055.3±1.637.7±0.87.72±1.3637±42.19±0.370.47±0.115.82±1.190.633±4125±1457.1±2.438.6±1.27.80±1.4637±72.11±0.160.43±0.065.61±0.361.337±12142±2156.0±1.837.9±1.28.62±1.7243±82.09±0.310.50±0.166.08±0.652.036±4141±1155.9±2.137.6±0.79.42±2.1637±42.05±0.300.44±0.116.20±0.49雄0.041±7149±2854.5±1.236.5±0.76.07±0.9931±61.46±0.300.66±0.196.14±1.300.645±5149±2154.7±1.336.6±0.85.94±0.8728±31.57±0.280.84±0.256.64±0.831.347±8150±2854.3±0.936.5±0.55.82±0.5030±31.49±0.250.75±0.096.36±1.132.042±8156±2553.8±1.936.3±1.05.94±0.5330±31.44±0.350.79±0.176.73±1.30

表9小鼠负重游泳时间、血浆尿素水平、肝糖原储备量、血乳酸曲线下面积†

Table9Weight-bearingswimmingtime,plasmaurealevel,hepaticglycogenreserveandareaunderbloodlacticacidcurveinmice(n=10)

剂量/(g/kg-1·BW·d-1)负重游泳时间/s血浆尿素/(mmol·L-1)肝糖原/(mg·g-1·Liver)血乳酸曲线下面积值0.00448±1557.98±0.6210.3±6.297±140.10587±1778.33±0.5422.5±2.4∗∗86±220.20591±1408.26±0.4321.1±5.4∗∗83±120.60661±163∗7.47±0.5417.4±5.8∗78±10∗

† *与阴性对照组比较，P<0.05；**与阴性对照组比较，P<0.01。

3 结论

研究结果表明，梅花鹿茸血冻干粉食用安全性，且具有缓解小鼠体力疲劳功能。推测是因为鹿茸血中作为血液蛋白来源的活性肽具有多种生理活性[17]，尤其是含有的睾酮具有维持肌肉强度及质量、提升体能等作用[18]。试验仅从动物试验的角度证实了鹿茸血冻干粉的安全性及缓解体力疲劳的作用，鉴于动物与人类之间的差异，对于人类食用来说是否安全及是否有明确的缓解体力疲劳作用还需进一步的试验研究。