利用植物挥发物提升冬季设施草莓蜜蜂授粉效率

张军飞，邱一蕾，柴秋子，余红，李红亮*

(1.中国计量大学 生命科学学院，浙江 杭州 310018；2.杭州市农业科学研究院，浙江 杭州 310024)

草莓(FragariaananassaDuch.)是一种蔷薇科植物，果实鲜美，深受广大群众喜爱[1]。草莓难以在野外过冬，因而目前冬季草莓以大棚栽培为主，即设施草莓。大棚内环境相对密闭，湿度大、空气流动性差，且缺少自然授粉媒介活动，并不利于草莓授粉受精，因此，需要采用人工授粉或者蜜蜂授粉的方法来提高授粉效率[2]。由于人工授粉费时费力，且效果不理想[3]，因此，目前设施大棚常采用中华蜜蜂授粉的方法来提高草莓的授粉率[4]。

中华蜜蜂(ApisceranaceranaFabricius，简称中蜂)是中国人工饲养规模最大的蜂种，善于采集零星蜜源，消耗饲料少，易于管理，耐低温(10 ℃左右仍能正常采集飞行)[5]，是冬季及早春温度较低状态下设施草莓授粉效果最佳的蜂种之一[6]。为了进一步提高蜜蜂的授粉效果，现有的可实施技术措施主要从作物栽培与蜂群管理出发——授粉作物需分布合理并处于良好的生长状态，根据作物情况合理配置与管理授粉蜂群，为蜂群提供作物蜜源的诱导信息，吸引蜜蜂采访[7]。然而，在实际栽培中很难满足上述所有条件，因而蜜蜂的授粉效果虽比人工授粉好，但仍未达到最优状态，也就是说，在蜜蜂的授粉效果上仍有很大的发挥空间。

在以活框饲养方式为主的传统养蜂业中，为了获取最大经济利润，蜂农往往会在入冬前将蜂群巢蜜割净，采用饲喂糖水的方式来维持蜜蜂的基本生存[8]。当这些中蜂被莓农用于其设施草莓授粉时，用传统非活框的圆木桶方式饲养，但饲喂方式基本不变。这种喷施糖水的方式给蜜蜂提供了足够的蜜源，使蜜蜂变得懒惰，长此以往反而会使蜜蜂不愿出去采蜜，从而导致其授粉效率下降。为了有效地提高冬季设施草莓授粉蜜蜂的活力和授粉效率，停用糖水饲喂方式，通过试验筛选出花香挥发物嗅觉活性剂，形成复合糖水增效剂，通过喷施复合糖水增效剂，诱导并促进蜜蜂工蜂出巢授粉，提高了中蜂嗅觉敏感性和其出巢、访花的频率，延长了单花停留时间，从而提升了授粉效率，为草莓增产增效提供了新途径。现总结报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

在中华蜜蜂嗅觉活性剂的筛选试验中，中华蜜蜂为本实验室内人工饲养的种群。在喷施复合糖水增效剂试验中，所用中蜂群购自杭州建德山区，采用常规的土法圆木桶法养殖。试验所用草莓品种为丰香，由杭州市农业科学研究院农业生物技术研究所提供。试验于杭州市农业科学研究院农业生物技术研究所草莓温室大棚基地进行。

触角电位仪由荷兰Syntech公司生产。β-紫罗兰酮，3,4-二甲基苯甲醛，苯甲醛，对羟基苯甲酸甲酯(HOB)，E,E-法尼醇，液状石蜡等化学试剂均购自百灵威公司(纯度>97%)。饲喂蜜蜂的糖水(质量分数25%)，用适量白砂糖溶解于灭菌水中配置而成，煮沸15 min，冷却后使用。

1.2 中华蜜蜂嗅觉活性剂成分的筛选

试剂及刺激样品的制备。选择活性较强的4种植物挥发物(β-紫罗兰酮、甲基丁香酚、3,4-二甲基苯甲醛、苯甲醛)和2种蜜蜂信息素(对羟基苯甲酸甲酯、E,E-法尼醇)进行试验。分别将供试的各化合物溶于液状石蜡，并配成10%溶液，在EAG昆虫触角电位测量系统上进行测定。剂量反应测试时，选择荧光结合试验中具有代表性的化合物，用溶剂作为对照。

触角电位测定。首先用手术刀将中华蜜蜂触角从基部切下，然后小心地将中华蜜蜂触角的两端用导电胶分别黏在EAG昆虫触角电位测量系统的金属电极上。观察显示屏上的基线变化情况，待基线平稳，表明触角已经稳定，且反应良好，可以开始试验。

在滤纸条上(2 cm×0.5 cm)滴加10 μL待测样品溶液，使溶剂挥发一会儿后，再将滤纸塞进巴斯德管内，用锡箔纸把管口两端封住，防止样品挥发。另取10 μL液状石蜡+滤纸作为空白对照。测试时，将巴斯德管一端插入送气管外侧直径2 mm的小孔内，送气管管口与触角纵向垂直，并与触角相距1 cm左右。同时点击手标和踩脚踏板，刺激时间0.2 s，刺激气流100 mL·min-1，2次刺激相隔2 min，以保证触角感觉器的感觉功能完全恢复。随机测定待测样品，由于随着时间延长，触角的生理活性也会跟着降低，为了避免此种情况对试验造成不利影响，以体积分数1%的叶醇-石蜡溶液作为标准参照刺激，对各测试样品的刺激反应进行标准化校正。预试验发现，中华蜜蜂对叶醇的反应存在稳定的峰值，所以选择叶醇作为标准参照。在测定样品前，先进行1次对照(液状石蜡)和标准参照刺激，然后测试5个样品，再进行对照和标准参照刺激，如此循环往复，每个触角约测试5个样品，每个待测样品重复6次。EAG反应值的计算公式如下：

式中：S为中华蜜蜂对某化合物EAG反应的相对值，Sc为中华蜜蜂对某化合物的EAG反应值，Cm为测定此化合物前后的对照2次EAG反应的平均值，Rm为测定此种化合物前的标准参照EAG反应的平均值。

1.3 复合糖水增效剂喷施对草莓授粉的效果测定

利用中蜂的自然授粉规律和嗅觉机理，通过1.2节试验筛选和设计了中蜂嗅觉活性剂成分。试验时，将温室大棚3等分，依次作为对照区、缓冲区和处理区。中蜂蜂桶处于缓冲区的中间点，蜂桶垫高50 cm左右，巢门朝南，待蜜蜂计数器安装、调试完毕后，进行试验，并记录相关数据。试验期间温室均不施用任何除草剂和杀虫剂，整个过程不饲喂糖水。将经筛选的中蜂嗅觉活性剂有效成分与25%的糖水混合，形成复合糖水增效剂，喷施于处理区，以25%糖水作为对照，同时记录同一时间段内蜜蜂的活动情况。

1.4 测量指标的定义和数据统计方法

在草莓盛花期进行试验时，将草莓大棚分为一个个规格2 m×2 m的样方。当中蜂进入样方访问第1朵花时开始用秒表计时，离开样方时停止计时，记录此间该中蜂访问的草莓花朵总数。将每只中蜂工蜂1 min内访问的草莓花总数定义为蜜蜂的访花频率；蜜蜂从接触一朵花到离开这朵花所经过时间定义为单花停留时间。

利用SPSS 16.0软件对获得的试验数据进行处理和分析。对EAG反应的相对值，做单因素方差分析，并用Duncan法进行多重比较。针对不同处理的蜜蜂访花频率、单花停留时间，用t-test进行检验。试验数据用Origin v8.5做图。

2 结果与分析

2.1 中华蜜蜂嗅觉活性剂成分筛选

研究中华蜜蜂对4种植物挥发物和2种蜜蜂信息素的EAG反应，结果如表1所示。中华蜜蜂工蜂对两种花香类物质(β-紫罗兰酮、甲基丁香酚)的反应值最大，其次是2种蜜蜂信息素(对羟基苯甲酸甲酯、E,E-法尼醇)，中华蜜蜂工蜂对β-紫罗兰酮、甲基丁香酚的嗅觉反应显著强于蜜蜂信息素，且中华蜜蜂工蜂对β-紫罗兰酮、甲基丁香酚的EAG反应值差异不显著。结果表明，β-紫罗兰酮、甲基丁香酚这2种花香类物质更能够引起蜜蜂的嗅觉反应，可以初步确定为嗅觉活性剂的有效成分。

表1 中华蜜蜂对植物挥发物和蜜蜂信息素的触角电位反应

注：同列数据后无相同字母的表示差异显著(P<0.05)。

2.2 复合糖水增效剂喷洒草莓对中蜂访花频率和单花停留时间的影响

选择β-紫罗兰酮代表植物挥发物，HOB代表信息素，分别构建糖水+嗅觉活性剂的组合。由图1可以看出，喷施糖水和添加HOB的复合糖水增效剂后，中华蜜蜂的访花频率并没有显著变化，但当喷施添加β-紫罗兰酮的复合糖水增效剂后，中华蜜蜂的访花频率较喷施糖水的处理显著增加。

喷施糖水后，相较于对照(空白)，中华蜜蜂的单花停留时间极显著延长；喷施添加β-紫罗兰酮的复合糖水增效剂后，相较于喷施糖水的处理，中华蜜蜂的单花停留时间极显著缩短；喷施添加HOB的复合糖水增效剂后，相较于喷施糖水的处理，中华蜜蜂的单花停留时间无显著变化。

综合上述结果，喷施糖水+β-紫罗兰酮的复合糖水增效剂能使蜜蜂的访花频率提高20.7%，有效提高蜜蜂的授粉活性，但以糖水+HOB配制的复合糖水增效剂对中华蜜蜂授粉活性并无显著影响。

图中标*或**的分别表示差异显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)。图1 不同处理对中华蜜蜂访花频率和单花停留时间的影响

3 讨论

昆虫利用嗅觉搜寻食物和配偶。对于蜜蜂而言，工蜂的出巢飞行轨迹与植物蜜源地密切相关。本研究中，中蜂对β-紫罗兰酮和甲基丁香酚，以及两种蜜蜂信息素(对羟基苯甲酸甲酯、E，E-法尼醇)的EAG反应值较大。β-紫罗兰酮是一种常见的植物花香类分子[9]。在前期研究中，发现其与中华蜜蜂的化学感受蛋白和气味结合蛋白都能够产生较强的结合[10]。而且，嗅觉蛋白与这些植物挥发物成分结合时，其结合常数随温度的升高而增加[11]。作为蜂王信息素的一种成分，对羟基苯甲酸甲酯与中蜂的一种信息素结合蛋白也能够产生较强的结合[12]，但与植物性气味不同的是，这种信息素与信息素结合蛋白的结合随温度的上升而下降，呈现静态猝灭特征[13]。本研究也发现，糖水和植物挥发素组合配置的复合糖水增效剂能有效提升蜜蜂在特殊环境下的活性，而糖水和信息素组合配置的复合糖水增效剂却无此效果。

利用糖水、糖水+β-紫罗兰酮、糖水+HOB处理草莓样方，记录中蜂的访花频率和单花停留时间，结果显示，糖水+β-紫罗兰酮的处理较糖水而言，能显著提高蜜蜂的访花频率，从而提高授粉活性，这为破解冬季低温弱光条件下蜜蜂活性低的问题提供了新的思路。

本试验中嗅觉活性剂均以糖水作为溶剂，是考虑到糖水具有蜜蜂敏感的食物气味，以其作为基础性的气味源有助于体现嗅觉活性剂的本底活性。本试验也证明，单独的糖水仅能延长蜜蜂的单花停留时间，对蜜蜂的访花频率并没有显著影响，必须加入相应的嗅觉活性剂，如β-紫罗兰酮才能够提高访花频率，从而提高蜜蜂的授粉活性。