一汉族念珠状发家系调查和Ⅱ型毛发角蛋白基因突变分析

王霞 杨阁 李凌 魏荣芳 熊春萍

1广州医科大学附属第一医院皮肤科510120；2梅州市人民医院皮肤科，广东梅州514023

念珠状发（monilethrix，OMIM：158000）是一种罕见的毛干结构异常的遗传性疾病［1］，1879年由Smith首次描述。该病多数为常染色体显性遗传，偶有呈常染色体隐性遗传的病例报道［2-3］。临床以毛干间断性规则或不规则缩窄进而形成念珠状毛发为特征，缩窄部易折断，头发呈局限性或弥漫性稀疏，短、干枯、无光泽，重者累及全身毛发，常伴毛囊角化性丘疹［4-5］。目前，国外学者认为该病的发生与毛发角蛋白基因突变可能有关［6］。然而，国内学者对念珠状发的研究较少，对该病的致病突变尚未明确。我们收集到一个中国广东籍汉族念珠状发家系，发现3代15人中存在4例念珠状发患者，我们对该家系成员进行分子遗传学研究，以期发现致病突变，为该病的诊断提供更多的理论依据。

一、资料与方法

1.临床资料：先证者女，8岁，广东省人，汉族，因毛发稀少7年余来广州医科大学附属第一医院脱发专科就诊。出生时头发无明显异常，在约2个月后，部分头发开始变得脆弱易折断，干燥而无光泽，容易拔出。头发稀疏，以枕部尤甚，冬季加重，春季缓解，无自觉症状。父母非近亲结婚，母亲妊娠期无特殊疾病和服药史，足月顺产。皮肤科检查：头部毛发弥漫性稀疏（图1A），多数为2 cm断发，外观异常，肉眼可见头部散在串珠状发，以枕部为多，项部见毛囊角化性丘疹，眉毛、睫毛正常。指趾甲正常。皮肤镜检查：右颞部毛发发生典型的念珠状改变，枕部较多毛发亦呈念珠状改变，散在少数断发，丘疹上见小黑点状断发（图2A）。光镜下病发膨大与缩窄交替出现，呈典型的规则串珠状改变（图2B）；扫描电镜检查示病发膨大部可见叠瓦状毛小皮，毛小皮基本正常（图2C），病发缩窄部可见大量毛小皮破坏、断裂、消失，并见明显的纵嵴、纵沟（图2D）。给予患儿2%米诺地尔溶液连续外搽9个月，毛发变密且明显变长（图1B），皮肤镜检查仍见念珠状发，但较先前减少。

图1 念珠状发先证者临床表现

图2 念珠状发患者毛发皮肤镜、光镜和扫描电镜下图像

调查显示，该家系3代共15人，对家系中毛发异常的成员同时进行皮肤镜、光镜和扫描电镜检查，发现4例患者（男2例，女2例，包括患儿）毛发存在典型的念珠状改变，符合念珠状发的初步诊断。该家系中男女均患病，呈垂直传递现象（图3），符合常染色体显性遗传模式特征。本研究经广州医科大学附属第一医院医学伦理委员会批准（医研伦审2019第K-04号），受试者均签署知情同意书。

图3 念珠状发家系图

2.DNA提取：抽取患者、14名家系成员和100例健康对照静脉血各5 ml，2%乙二胺四乙酸抗凝，-80℃冻存。采用全血基因组DNA提取试剂盒（北京天根生化科技有限公司）提取外周血DNA。

3.PCR扩增：参考以往研究结果，念珠状发突变位点集中在Ⅱ型毛发角蛋白1（hHb1）、hHb3和hHb6外显子1和7上，因此采用Primer 5.0引物设计软件针对hHb1、hHb3和hHb6外显子1和7设计引物，扩增目标序列及超出目标序列边界（内含子内）50 bp的序列，引物由生工生物工程（上海）有限公司合成（表1）。

PCR反应体系为50μl，其中反应液包括5μl缓冲液、0.5μl 10 mmol/L dNTP、上下游引物各0.5μl、Taq酶0.5μl、25 mmol/L MgCl25μl、二甲基亚砜1.5μl、DNA模板10μl。反应条件：94℃预变性1.5 min，94℃30 s，62℃30 s，72℃60 s，共35个循环。PCR产物用15 g/L琼脂糖凝胶电泳分析。将PCR产物送至广州基地奥生物科技有限公司测序，将结果与NCBI中GenBank数据库目标基因序列进行比对，分析突变位点。

表1 hHb1、hHb3和hHb6基因外显子1和7的引物序列

二、结果

电泳检测显示在患者、家系成员和对照组样本中均扩增出hHb1、hHb3和hHb6基因外显子1和7序列，其中hHB6基因外显子7扩增条带长465 bp。

测序结果显示，患者及其他家系成员和对照组的hHb1、hHb3外显子1和7及hHb6外显子1均未见突变。先证者及家系中其他3例患者在hHB6基因外显子7第1 237位碱基处均存在杂合突变（G＞A），导致编码氨基酸的密码子由CGA突变为CAA（谷氨酸突变为赖氨酸，即E413K），而家系健康成员及100例健康对照未检测到该突变，测序结果见图4。

图4 念珠状发患者及健康对照hHB6基因第7外显子PCR产物测序图

三、讨论

念珠状发具有较高的外显率和不同的临床表现［7］。自1997年Winter等［8］发现第一个念珠状发hHb致病突变至今，共发现10种hHb点突变与念珠状发相关［9-10］。这些突变全部发生于Ⅱ型毛发角蛋白hHbl、hHb3和hHb6基因。目前，国内在念珠状发患者中发现两种杂合突变，分别为hHb6基因E402K和R430Q［11-13］。本研究中，我们发现一念珠状发家系中4例患者hHb6基因外显子7第1 237位碱基存在G＞A转变，即E413K。在PubMed、中国知网和万方医学等数据库中以“念珠状发、hHb、基因和突变”等为关键词检索，国内未发现hHb6基因E413K突变位点的报道，但该突变在国外报道中是念珠状发的一个突变热点［14］。hHb6位于毛发角蛋白的2B区，该区域在角蛋白中间丝装配中起重要作用。分子动力学研究表明，谷氨酸突变为赖氨酸可引起突变区域肽链构象的显著变化及原子/基团间静电相互作用力的改变，进而影响角蛋白中间丝的装配及稳定性［15］，稳定性发生改变的中间纤维丝会导致患者的头发呈念珠状［16］，因此该突变可能是导致本文家系患者念珠状发的原因。

念珠状发呈慢性病程，目前临床上尚无确切有效的治疗方法。近期有报道外用米诺地尔溶液以及口服阿维A类制剂治疗有效［17］。考虑到先证者为女童，所以选择2%米诺地尔溶液外搽，治疗9个月后取得良好的效果，而停药2年后随访毛发仍持续变密，推测可能是用药期间米诺地尔溶液通过促进毛发生长期的发育和扩张头皮血管促进毛发生长，同时本病随年龄增长有自行缓解趋势，其具体机制有待进一步研究。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突