泛素结合酶2S在恶性黑素瘤中的表达及其对黑素瘤细胞生物学行为的影响

马阳阳 王平 胡文婷 徐永平 张小燕 黎钊 虞闻仲 朱蒙燕 许爱娥

1浙江中医药大学，杭州310009；2杭州市第三人民医院皮肤科310009；3浙江省义乌市皮肤病医院皮肤科322000

泛素化是一种翻译后修饰，在细胞周期、增殖及凋亡中发挥重要作用，它将泛素与泛素-蛋白酶体系统结合，泛素-蛋白酶体系统由3种酶即泛素活化酶、泛素结合酶2（UBE2）和泛素连接酶组成［1］。作为一种泛素结合酶，UBE2S又称E2-EPF UCP，具有高度保守的150个氨基酸核心结构，与泛素连接酶后期促进复合物（APC/C）结合，拉长靶蛋白上的泛素链，促使底物降解，其异常调控参与炎症因子核因子κB与转化生长因子β（TGF-β）、促有丝分裂生长因子和缺氧诱导因子（HIF）的信号转导，驱动多种肿瘤细胞的增殖、迁移和转移［2-3］。既往研究显示，UBE2S在多种疾病中表达上调，包括宫颈癌、口腔鳞状细胞癌（OSCC）、乳腺癌及转移性结肠癌等恶性肿瘤，并与肿瘤生长、G2/M期阻滞密切相关［3-4］。然而，有关UBE2S在恶性黑素瘤（MM）中的研究报道极少，其作用机制尚不清楚。我们通过检测UBE2S在MM组织中的表达，了解其与肿瘤分期（化）的相关性，并通过研究UBE2S对MM细胞功能及侵袭性的影响，探讨其对MM预后评估的价值，为筛选MM分子治疗的新靶点提供理论依据。

材料与方法

一、主要材料

黑素瘤细胞株（A375、MUM-2B及MUM-2C）、293T细胞及慢病毒表达载体由上海吉凯公司提供，DMEM培养基（美国Corning公司），胎牛血清（美国Ausbian公司），MM及正常组织芯片+标记点（西安艾丽娜生物科技有限公司，货号ME2082c），兔抗UBE2S抗体（美国Sigma公司），辣根过氧化物酶标记的兔抗人IgG抗体（美国Sigma公司），兔抗N-钙黏蛋白抗体（美国CST公司），鼠抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）抗体（美国Santa-Cruz公司），Vulcan fast red chromogen kit2染色液（美国Concord公司），Trizol试剂（上海普飞生物技术有限公司），M-MLV反转录试剂盒及Caspase-Glo®3/7 Assay试剂盒（美国Promega公司），SYBR premix ex tap PCR试剂盒（日本TaKaRa公司），凋亡检测试剂盒（美国eBioscience公司），碘化丙锭（美国Sigma公司），流式细胞仪（美国Millipore公司），Transwell试剂盒及侵袭检测试剂盒（美国Corning公司），荧光显微镜（上海蔡康光学仪器有限公司）。

二、实验方法

1.免疫组化检测MM组织中UBE2S基因的表达：MM及非瘤组织芯片共208例，包括原发性MM 128例、转移性MM 64例、非瘤组织16例（瘤旁组织及正常表皮组织各8例）。将组织芯片进行免疫组化检测，用柠檬酸钠缓冲液（pH6.0）在微波炉中进行抗原修复20 min，用10%血清封闭30 min；加入一抗（兔抗UBE2S抗体1∶100）孵育过夜，Tris-HCl缓冲盐溶液（TBS）冲洗；加入二抗（兔抗人IgG抗体）孵育60 min，TBS冲洗。用Vulcan fast red chromogen kit2染色试剂按照说明书染色。染色结果判定标准：①按染色强度评分，分为0～34个等级；②按染色阳性率评分：阴性为0，1%～25%为1，26%～50%为2，51%～75%为3，76%～100%为4。按染色强度和染色阳性率乘积值分组，≤6分为抗体低表达组，＞6分为抗体高表达组。

2.实时定量PCR检测黑素瘤细胞株中UBE2S mRNA相对表达水平：使用Trizol试剂分别提取A375、MUM-2B及MUM-2C细胞株总RNA，分别取2μg样本使用M-MLV反转录试剂盒按照标准流程将RNA反转录成cDNA，使用SYBR premix ex tap PCR试剂盒按说明书扩增目的基因。由上海吉凯基因化学技术有限公司设计和合成引物。UBE2S正向引物5′-GTGCTCAAGAGGGACTGGACG-3′，反向引物5′-GCAGACTCGGGGTTAGGGTG-3′，片段大小为92 bp。GAPDH正向引物5′-TGACTTCAAC AGCGACACCCA-3′，反向引物5′-CACCCTGTTGTA GCCAAA-3′，片段大小为121 bp。采用两步法反应，条件为95℃30 s；95℃5 s，60℃30 s，共40个循环。以GAPDH作为内参照基因，以2-△△Ct表示UBE2S相对表达水平，其中△Ct=目的基因Ct值-GAPDH基因Ct值，△△Ct=各样品△Ct值-对照组△Ct值。

3.UBE2S基因shRNA慢病毒感染A375及MUM-2B细胞：用病毒包装辅助质粒（上海吉凯公司）与携带目标序列miRNA的GV115质粒共同转染293T细胞，48 h后收集细胞培养上清液进行慢病毒的浓缩与纯化。将A375及MUM-2B细胞分别分为两组，干扰组使用含有UBE2S RNA干扰序列（5′-ACATCATCCGCCTGGTGTA-3′）的慢病毒转染，对照组使用含有对照序列（5′-TTCTCCGAACGT GTCACGT-3′）的慢病毒转染，72 h后，荧光显微镜检测绿色荧光蛋白的表达情况，荧光率达70%～80%时收集细胞，实时定量PCR检测UBE2S mRNA相对表达水平，方法同前。

4.各组细胞中caspase3/7的表达检测：将经过上述处理的A375及MUM-2B细胞计数并按照1×104细胞/孔加入96孔板中。使用Caspase-Glo®3/7 Assay试剂盒按照说明书检测细胞中caspase3/7的表达。

5.流式细胞仪检测细胞凋亡与周期情况：将经过上述处理的A375、MUM-2B细胞在6孔板中传代培养至覆盖率为80%，胰酶消化，1 300 r/min（离心半径为20 cm）离心5 min后，向部分细胞中加入10μl膜联蛋白V-别藻蓝蛋白在室温下染色15 min，另一部分加入0.7 ml碘化丙锭染色液使上机时细胞通过率为300～800个/s，采用流式细胞仪检测细胞凋亡与周期情况。

6.Transwell法分析细胞迁移及侵袭能力：将干扰组与对照组A375细胞按8×104/孔接种，分别取细胞悬浮液100μl加入Transwell小室上室，下室加600μl 30%胎牛血清培养基。37℃培养16 h后使用Giemsa染色液染色转移细胞2～3 min后观察并拍照。每个Transwell小室随机选取3个200×视野进行细胞计数。

取侵袭试剂盒上室铺Matrigel基质加入细胞悬浮液500μl，下室加750μl 30%胎牛血清培养基，37℃培养16 h后染色3～5 min，每个小室随机选取3个200×视野进行细胞计数。

7.Western印迹法检测N-钙黏蛋白的表达：取干扰组与对照组A375细胞用PBS洗涤，冰上裂解10～15 min后超声破碎细胞，取上清液用BCA法测定蛋白浓度，经浓度标化后进行Western印迹检测。取20μg总蛋白，经10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，将蛋白转移到聚偏二氟乙烯膜上室温下封闭1 h。加入一抗兔抗N-钙黏蛋白（1∶500），以鼠抗GAPDH（1∶2 000）为内参照，室温孵育1 h，用TBST洗涤聚偏二氟乙烯膜后加入对应的N-钙黏蛋白标记的兔抗人IgG二抗（1∶2 000）室温孵育2 h。洗膜后采用Pierce™ECL Western Blotting Substrate试剂盒（美国Thermo公司）进行X光显影，并按说明书要求进行X线胶片处理。

8.统计学分析：所有实验重复3次以上。使用SPSS 22.0软件分析。符合正态分布的计量资料用±s表示，组间比较采用独立样本t检验，计数资料采用卡方检验。非正态分布的数据采用Mann-WhitneyU检验。用Spearman秩相关系数评估UBE2S表达与肿瘤分期的相关性。P＜0.05认为差异有统计学意义。

结 果

一、UBE2S在MM组织中的表达

免疫组化检测显示，UBE2S在MM及非瘤组织细胞的细胞质中均有表达。192例MM组织中，98例（51.0%）高表达UBE2S；16例非瘤组织中未见高表达，高表达率差异有统计学意义（χ2=11.905，P＜0.01）。UBE2S在不同T分期的瘤组织中表达水平差异有统计学意义（χ2=4.110，P=0.044）。Spearman秩相关分析提示该基因在瘤组织中的表达水平与患者的T分期呈负相关（斯皮尔曼相关系数ρ=-0.210，P=0.043）。见表1、图1。

表1 泛素结合酶2S（UBE2S）在恶性黑素瘤组织中的表达水平与临床资料的相关性分析（例）

二、A375、MUM-2B、MUM-2C细胞株UBE2S mRNA相对表达水平

A375、MUM-2B、MUM-2C细 胞 内UBE2S mRNA相对表达量分别为5.96±0.12、8.91±0.06、5.25±0.15，表达丰度都较高，不同细胞之间UBE2S mRNA表达差异有统计学意义（F=817.228，P＜0.01），以MUM-2B细胞株表达量最高，其后依次为A375、MUM-2C细胞株，选择A375及MUM-2B细胞株进行shRNA慢病毒感染。

三、shRNA转染效率及对UBE2S mRNA表达的影响

将shRNA转染的4组细胞培养72 h后，随机选5个视野计算转染效率在80%以上，细胞状态正常。实时定量PCR检测显示，干扰组及对照组A375细胞UBE2S mRNA相对表达量分别为0.312±0.005、1.001±0.042，两组间差异有统计学意义（t=-28.052，P=0.001）；干扰组及对照组MUM-2B细胞UBE2S mRNA相对表达量分别为0.548±0.083、1.002±0.072，两组间差异亦有统计学意义（t=-7.188，P=0.002）。

四、敲减UBE2S基因对黑素瘤细胞凋亡及细胞周期的影响

感染3 d后，干扰组与对照组A375细胞caspase3/7活性分别为14 522.7±138.25与7 351.7±693.18，干扰组显著高于对照组（t=17.572，P＜0.01）；干扰组较对照组MUM-2B细胞caspase3/7活性亦明显增加（分别为17 276.3±178.959、12 442.3±290.294，t=24.552，P＜0.01）。与对照组A375及MUM-2B细胞相比，干扰组A375及MUM-2B细胞凋亡率显著增加（均P＜0.01）。与对照组A375细胞相比，干扰组细胞G1期细胞比例明显增多（P＜0.01），而S期细胞明显减少（P＜0.01），G2/M期细胞无明显变化（P＞0.05）.与对照组MUM-2B相比，干扰组MUM-2B细胞G1期（P＜0.01）、G2/M期（P＜0.01）比例明显增多，S期细胞比例明显减少（P＜0.01）。见图2、表2。

图3 敲减泛素结合酶2S基因对A375细胞迁移、侵袭的影响（×200）

表2 敲减泛素结合酶2S基因对A375细胞及MUM-2B细胞凋亡率与周期分布的影响（%，±s）

表2 敲减泛素结合酶2S基因对A375细胞及MUM-2B细胞凋亡率与周期分布的影响（%，±s）

注：n=3

组别A375细胞对照组干扰组t A375值P A375值MUM-2B细胞对照组干扰组t MUM-2B值P MUM-2B值凋亡率G1期S期G2/M期4.58±0.15 8.26±0.18 27.236 0.001 59.85±1.48 67.21±0.90 7.365 0.002 31.75±0.67 24.66±1.34-9.190 0.001 8.40±1.99 8.13±0.61-0.227 0.831 4.40±0.13 7.07±0.13 25.374 0.001 36.55±0.19 38.70±0.22 12.676 0.001 45.42±0.55 37.23±0.72-15.718 0.001 18.03±0.58 24.08±0.56 13.045 0.001

五、敲减UBE2S基因对A375细胞迁移、侵袭能力及N-钙黏蛋白表达的影响

见图3。Transwell实验显示，对照组和干扰组A375细胞每200×视野转移细胞数分别为260±9.3、51±3.7，干扰组A375细胞迁移能力显著降低（t=-35.727，P＜0.05）。侵袭小室实验显示，对照组和干扰组A375细胞透过Matrigel基质的细胞数分别为109±0.8、26±0.7，干扰组细胞侵袭能力显著降低（t=-125.000，P＜0.01）。Western印迹检测显示，A375细胞敲减UBE2S基因后，N-钙黏蛋白表达下调（图4）。

图4 敲减泛素结合酶2S对A375细胞N-钙黏蛋白表达的影响

讨 论

与普通免疫组化切片相比，组织芯片技术可以大规模、高通量、标准化地在基因组、转录组和蛋白质组水平进行研究，在肿瘤相关基因研究中发挥重要作用［5］。我们使用MM及非瘤组织芯片进行免疫组化检测，并且结合临床资料进行判读。本研究表明，UBE2S在MM组织中明显高表达，而瘤旁组织及正常对照组织低表达，提示UBE2S可能与MM的恶性生物学行为有关，可作为MM的免疫标志之一。UBE2S在OSCC中的表达水平与肿瘤分期呈正相关［4］。本研究显示，UBE2S在T1/T2/T3期MM中呈高表达，而T4期表达水平却明显下降，提示黑素瘤细胞可能具有不同于其他恶性肿瘤的细胞分化特征，也反映了MM显著的异质性。

本研究结果显示，UBE2S在A375、MUM-2B、MUM-2C细胞中表达丰度都为高，以MUM-2B表达量最高，其次为A375、MUM-2C。而且，敲减UBE2S基因后，黑素瘤细胞凋亡水平明显增高，细胞迁移及侵袭能力显著降低，证实UBE2S对MM细胞生物学功能的影响。UBE2S过表达被报道与OSCC［4］、肾癌［6］及食管癌［7］的细胞增殖、侵袭及转移能力上调有关，但敲减UBE2S基因对宫颈癌及乳腺癌细胞增殖无明显影响［8-9］。Yoshimura等［4］报道敲减OSCC细胞UBE2S基因，可通过促进P21降解抑制G2/M期细胞增殖。而Tedesco等［9］报道在乳腺肿瘤中，UBE2S常与细胞周期G2/M期的基因共同表达。本研究显示，敲减UBE2S基因的黑素瘤细胞阻滞于G1/S期，进一步表明UBE2S在不同来源肿瘤中的功能差异。

UBE2S参与Von Hippel-Lindau泛素（VHL）的蛋白酶体降解，VHL介导HIF1α的泛素化降解，HIF刺激原癌发生和促分裂生长因子相关基因表达［10］。UBE2S与HIF1α在胰腺癌、黏液性结肠癌、乳腺癌中过度表达，而VHL表达下调［9-10］。UBE2S在转移性皮肤癌CAKI细胞和人黑素瘤C8161细胞中表达上调，通过HIF1α和血管内皮生长因子（VEGF）的转录调节VHL降解，促进细胞增殖［10］。研究发现，UBE2S可能通过调节VHL/HIF1α—TGF-β1通路来诱导上皮细胞-间充质转化（EMT）过程［7，11］。EMT是一种由上皮向间充质细胞型转变的生物学过程，是肿瘤侵袭过程中的关键环节，该过程降低肿瘤转移中细胞黏附并促进细胞脱落［12-13］。在此过程中，黏附分子N-钙黏蛋白表达上调，上皮细胞失去极性，形成有利于恶性肿瘤转移的迁移、侵袭和抗凋亡特性［13］。本研究显示，敲减UBE2S基因后，A375细胞中N-钙黏蛋白表达下调，提示UBE2S可能通过调控EMT过程中的N-钙黏蛋白促进MM细胞转移。

综上所述，我们发现，UBE2S在MM组织中高表达且与患者肿瘤分期呈负相关，敲减UBE2S基因后MM细胞迁移、侵袭和EMT过程受到抑制，细胞凋亡率增高，细胞周期阻滞于G1/S期，提示UBE2S可能作为关键驱动基因影响MM的发展和预后，为筛选MM分子治疗的靶点提供了部分理论基础，但具体机制和应用价值尚需进一步研究。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突