马铃薯茎尖脱毒新方法探析

左静静，闫贵云，霍利光，左 敏

（山西省农业科学院作物科学研究所，作物遗传与分子改良山西省重点实验室，山西太原030031）

马铃薯是一种粮、菜、饲、工业原料兼用型经济作物，产量高，营养丰富，适应性强，分布广[1-2]。2015 年1 月，农业部制定的《2015 年种植业工作要点》已经把马铃薯列为重点，今后马铃薯将逐渐成为我国第四大主要粮食作物[3]。马铃薯生产中，存在的病毒和类病毒共有十几种[4]，在我国马铃薯产区普遍存在马铃薯X 病毒（PVX）、马铃薯A 病毒（PVA）、马铃薯Y 病毒（PVY）、马铃薯S 病毒（PVS）、马铃薯卷叶病毒（PLRV）以及马铃薯纺锤状块茎类病毒（PSTVd）[5-7]。这些病毒和类病毒使马铃薯品种退化，在马铃薯的连年种植过程中，产量和品质逐年下降，而解决退化的有效措施就是生产脱毒种薯，然而马铃薯脱毒苗茎尖分生组织体积约为0.5 mm，因此，在其脱毒中成苗率低，畸形化严重[8]。

当前脱毒马铃薯脱毒种薯主要使用的脱毒方法为：选取块茎、植株芽条或者带病毒试管苗结合热处理常规消毒处理，在无菌条件中解剖镜下剥离分生组织，培养、成苗、扩繁、病毒及类病毒检测，经遗传稳定性鉴定后工厂化快速繁殖使用[9-12]。该技术是目前马铃薯茎尖脱毒的一般程序，但存在的不足之处有：脱毒周期长、环节多，需要经过热处理使病毒钝化[13]，茎尖剥离以后需进行愈伤及成苗培养，获得脱毒苗以后还需要进行稳定性鉴定[14]。它对技术和设备要求高，需要解剖镜，茎尖剥离的操作很细致，茎尖不能过大或过小，过大脱毒率低，过小不易成活[15-17]。此外，茎尖剥离后在愈伤培养时会在培养基内加一些激素，分生组织受这些激素影响可能会产生遗传变异，并且马铃薯茎尖细胞非常小，存在遗传物质不完整的风险。

目前，也有部分学者通过将需要脱毒的原原种进行田间播种，在现蕾或开花期从马铃薯地里筛选健康的植株，做好标记，较其他植株提前15 d 收获[18-19]。每株筛选个大、薯型标准和健康的种薯单独收获和贮存；种薯发芽后，剪取幼芽进行病毒检测[20]；将检测健康的种薯重新催芽后，剪取大芽经酒精和升汞杀菌处理后，放于常规MS 固体培养基上做成茎段苗；将长高的茎段苗剪取上部1/3 高度保种，剩余2/3 进行病毒检测；病毒检测合格后，按照常规方法进行快繁。该技术病毒检测合格率低，制苗效率低且成本较高[21-22]。

本试验针对目前马铃薯茎尖脱毒方法中存在的这些问题，结合多年研究和实践操作经验，总结出了一套高效且保证品质的马铃薯茎尖脱毒新方法。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试马铃薯品种为晋薯16 号、克新1 号、冀张北12 号、农家种，其中，晋薯16 号为山西省农业科学院高寒区作物研究所审定品种，克新1 号为黑龙江省农业科学院审定品种，冀张北12 号为河北省张家口农业科学院审定品种，农家种为当地农民自繁自种品种。

1.2 试验方法

（1）将需要脱毒的马铃薯块茎埋于土壤中，置于四周遮光、顶部透光环境中催芽，发芽后在20～25 ℃下进行拔高培养。（2）待催生的芽长到50～80 cm 时，在最高的茎上剪取0.8～1.0 cm 的茎尖，用洗洁精水浸泡后洗净，然后清水中浸泡后冲洗干净，接着用75%酒精表面消毒30 s，然后用0.05%升汞灭菌10 min，无菌水冲洗4～5 次，接种于MS培养基上，pH 值5.8～6.4，培养茎尖苗。（3）茎尖苗在温度25～28 ℃、光照强度2 200～2 500 lx 下每天光照12 h 进行培养。（4）待茎尖苗长高到7～8 cm时，在超净台上剪取0.2 mm 的茎尖（以肉眼可见为准），置于培养基中按步骤（3）的培养条件进行培养。（5）重复步骤（4）4～5 次后剪取茎尖保种，剩余茎段进行病毒检测。（6）病毒检测合格后，脱毒完成。

病毒检测由农业部脱毒马铃薯种薯质量监督检测测试中心进行。所用主要仪器是酶标仪和杂交箱。检测标准为NY/T401—2000，NY/T2744—2015。

2 结果与分析

4 个供试品种晋薯16 号、克新1 号、冀张北12号、农家种脱毒之后，依次编号2017-W-161、2017-W-162、2017-W-163、2017-W-164 进行马铃薯病毒检测，每个样本检测马铃薯6 种病毒（PVX、PVY、PVS、PVM、PVA、PLRV）和1 种类病毒（PSTVd）。马铃薯种薯质量监督检测测试中心的检测结果列于表1。在所检测的样品中样本2017-W-161 携带病毒PVX 和PVY；样本2017- W-162 携带病毒PVY 和类病毒PSTVd；样本2017-W-163 携带病毒PVA 和类病毒PSTVd；样本2017-W-164 携带病毒PVX、PVA 和类病毒PSTVd。经本研究方法的脱毒之后，检测4 个样本中均不含以上6 种病毒和1 种类病毒。

表1 4 个马铃薯样本的病毒检测结果

3 结论与讨论

病毒在植物体内分布不均匀，根尖和芽尖的分生组织含病毒量少或不含病毒。病毒复制须利用寄主的代谢过程，而分生组织缺乏真正的维管组织，当遇到分生组织旺盛的新陈代谢活动时，病毒的复制无法与分生组织旺盛的代谢活动竞争，大多数病毒在植株内通过韧皮部进行迁移，或在细胞间通过胞间连丝传输，因为细胞与细胞间的移动速度较慢，在快速分裂的组织中病毒浓度高峰被推迟，以及分生组织的生长素浓度通常很高，可能影响病毒的复制，因此，在新生长出的芽端极小的范围内，病毒的含量几乎为零。

试验结果表明，本研究方法解决了现有马铃薯茎尖脱毒存在脱毒周期长、脱毒苗易发生变异、制苗成本高且病毒检测合格率低的问题，提供了一种马铃薯茎尖的重复培养脱毒方法。其大大简化了脱毒的步骤，不需要经过热处理操作，简化了茎尖剥离的步骤，撇开了解剖镜下的细微操作，避免了因茎尖过小而丢失遗传物质的问题；而且茎尖剥离后的培养不添加激素，大大降低了产生遗传变异的概率；同时拔高培养及茎尖苗培养参数的选取是通过大量反复试验得出的。

本研究表明，马铃薯X 病毒（PVX）、Y 病毒（PVY）、A 病毒（PVA）和类病毒（PSTVd）可以用以下高效的脱毒方法：选取薯块拔高培养，待芽长到50～80 cm 时，剪取最高的0.8～1.0 cm 的茎尖，75%酒精消毒30 s，0.05%氯化汞消毒10 min，置于MS 培养基中，在温度25～28 ℃、光照强度2 200～2 500 lx 下每天光照12 h 进行培养；待茎尖苗长到7～8 cm 时，在超净台上剪取0.2 mm 的茎尖（以肉眼可见为准），置于MS 培养基中继续培养，培养条件不变，重复培养4～5 次后剪取茎尖保种，剩余茎段进行病毒检测，脱毒完成。