丁苯酞通过SIRT1/NF-κB信号通路抑制阿尔茨海默病大鼠海马神经元凋亡的机制研究*

刘雅林， 谢兰兰， 王丽云， 赵瑞杰， 许 峰， 王文胜

(河北省邢台市人民医院神经内科， 河北 邢台 054000)

阿尔茨海默病(Alzheimer disease，AD)是老年性痴呆症中最常见的一种神经退行性疾病，临床上常见的病理表现主要有记忆力下降、执行功能障碍和行为改变等[1-2]。随着我国老龄化的加剧，AD的发病率有明显升高的趋势，严重影响着人们的生活质量，因此，AD的改善和治疗已成为我国亟待解决的社会问题。随着医学领域发展，尽管在AD的发病机制和治疗药物的研究等方面有所突破，但仍然缺乏特异性的治疗药物与方法，AD的防治仍是医学界面临的重大难题。海马是神经系统中与学习记忆通路关系密切相关的大脑组织，海马神经元的凋亡被认为是导致学习记忆功能障碍的重要因素[3-4],因此，如何减少海马神经元的凋亡以改善AD的认知能力可能是防治AD的策略。

丁苯酞(butylphthalidle，NBP)是一种临床上治疗轻、中度急性缺血性脑卒中等疾病的常用药，具有改善脑部供血、抗脑血栓形成、拮抗自由基损伤及抑制神经元凋亡的作用[5-6]。沉默信息调节因子1(silent information regulator 1，SIRT1)是sirtuins去乙酰化酶家族成员，可通过使底物去乙酰化从而调控基因的表达，参与细胞凋亡与衰老、炎症反应和氧化应激等过程。研究证实[7-8]，SIRT1可通过去乙酰化作用修饰RelA/P65的残基抑制核因子κB(nuclear factor-κB,NF-κB)的活性，从而减少神经元凋亡，在神经保护过程中发挥着重要作用。有研究指出[9]，丁苯酞可通过上调Bcl-2，并下调Bax和caspase-3蛋白的表达抑制海马神经元凋亡，但其有无介导SIRT1/NF-κB信号通路参与这一过程并不清楚。因此，我们通过构建AD大鼠模型，探讨丁苯酞通过调控SIRT1/NF-κB信号通路对海马神经元凋亡的影响，以期为丁苯酞防治AD提供参考资料。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1实验动物 63只SPF级健康成年雄性SD大鼠(体重260～290 g)购于苏州大学医学院实验动物中心，许可证号为SCXK(苏)2018-0006。饲养条件：温度27 ℃，湿度45%～65%，通风良好，自由摄食与饮水，适应性喂养7 d后进行实验。

1.2试剂与仪器 丁苯酞购自石药集团恩必普药业有限公司；DMEM培养液、胎牛血清和胰蛋白酶购自Gibco；生理盐水购自石家庄第四制药厂；苏木素和伊红购自武汉博士德生物公司；水合氯醛购自上海化学试剂有限公司；抗Bcl-2和Bax多克隆抗体购自北京中杉金桥生物技术公司；抗β肌动蛋白(β-actin)和p-NF-κB p65 单克隆抗体购自Santa Cruz Biotechnology；抗p-NF-κB抑制蛋白α(inhibitor of NF-κB α,IκBα)和cleaved caspase-3多克隆抗体购自Cell Signaling;二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白检测试剂盒购自上海生工有限公司；细胞凋亡检测试剂盒购自Invitrogen。石蜡组织切片机购自Leica；流式细胞仪购自BD;CO2细胞培养箱购自Forma Scientific；光学显微镜购自Olympus。

2 方法

2.1AD大鼠模型的制备与实验分组 按照大鼠体重10 mL/kg的标准每天以5 mg/kg氯化铝(AlCl3)灌胃联合腹腔注射60 mg/kg D-半乳糖的方式构建AD大鼠模型，给药处理3个月。将63只SD大鼠随机分为9组，每组7只，分别为对照(control)组：同时间给予等体积的生理盐水灌胃；模型(model)组：上午7点以生理盐水灌胃，下午给予AlCl3灌胃和D-半乳糖腹腔注射；丁苯酞低剂量(low dose of NBP, NBP-L)、中剂量(middle dose of NBP, NBP-M)和高剂量(high dose of NBP, NBP-H)组：上午同时间给予25、50和100 mg/kg丁苯酞灌胃，下午同时间给予AlCl3灌胃和D-半乳糖腹腔注射；SIRT1激活剂(SRT1720)组：上午同时间给予终浓度为16 μmol/L的SIRT1激活剂SRT1720灌胃，下午同时间给予AlCl3灌胃和D-半乳糖腹腔注射；SIRT1抑制剂(sirtinol)组：上午同时间给予终浓度为80 μmol/L的SIRT1抑制剂sirtinol灌胃，下午同时间给予AlCl3灌胃和D-半乳糖腹腔注射；丁苯酞中剂量+SIRT1抑制剂(NBP-M+sirtinol)组：上午同时间给予50 mg/kg丁苯酞和终浓度为80 μmol/L的SIRT1抑制剂sirtinol灌胃，下午同时间给予AlCl3灌胃和D-半乳糖腹腔注射；丁苯酞中剂量+ddH2O(NBP-M+ddH2O)组：上午同时间给予50 mg/kg丁苯酞和等量蒸馏水灌胃，下午同时间给予AlCl3灌胃和D-半乳糖腹腔注射。

2.2HE染色 给药处理结束后，每组随机选取3只大鼠，腹腔注射10%水合氯醛麻醉后，断头取脑组织。参照Paxinos第3版大鼠脑解剖图定位海马区，取海马区组织，以冷冻切片机制备片厚20 μm的组织冠状切片。将制备的海马区组织切片浸泡于二甲苯中10 min后，更换二甲苯再浸泡10 min，再依次分别置于浓度为100%、 95%、90%、80%和70%的乙醇中浸泡10 min。经蒸馏水洗涤后，以苏木素染色1 min，1%盐酸分化10 s和伊红染色2 min;再依次经70%、80%、90%和95%梯度的乙醇脱水、二甲苯透明和中性树胶封片。采用光学显微镜观察海马区神经元的形态及密度。

2.3流式细胞仪检测 取海马组织，以0.25%胰蛋白酶消化，并以DMEM培养基(含10%胎牛血清)终止消化，以12 000×g离心10 min收集细胞后，采用预冷的磷酸盐缓冲液洗涤细胞。以结合缓冲液重悬细胞，再参照细胞凋亡检测试剂盒说明书按步骤分别加入异硫氰酸荧光素标记的膜联蛋白-V和碘化丙啶，避光条件下充分混匀后，上流式细胞仪检测。实验重复3次。

2.4Western blot检测 取海马组织，研磨成浆后，加入细胞裂解液提取总蛋白，并参照BCA蛋白定量试剂盒对总蛋白进行定量。调整上样蛋白浓度为50 μg，加入等量的2×上样缓冲液，经沸水浴变性5 min后，行SDS-PAGE。电转印至硝酸纤维素膜上后，浸泡于含5%脱脂奶粉的封闭液中常温孵育1 h。再分别与封闭液稀释的特异性Ⅰ抗(1∶1 000)室温孵育3 h，辣根过氧化物酶标记的Ⅱ抗(1∶5 000)室温孵育2 h。经封闭液洗膜后，以化学发光剂显色曝光，分别以SigmaScan Pro 5软件采集图像，以β-actin为内参照，GraphPad Prism 5软件分析目的蛋白的相对表达量。实验重复3次。

3 统计学处理

实验数据以均数±标准差(mean±SD)表示，采用SPSS 22.0进行统计学分析，多组间比较使用单因素方差分析，组间多重比较采用SNK-q检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 丁苯酞改善AD大鼠海马神经元的形态

对照组大鼠海马神经元排列紧密整齐，层次清楚，神经元核呈圆形，形态正常；模型组大鼠海马神经元排列紊乱，可见疏松区，神经元核固缩，小胶质细胞明显增生；与模型组相比，丁苯酞低、中和高剂量组海马组织病理变化有明显改善，神经元排列较有序，部分神经元核呈圆形，数目明显增多，见图1。

Figure 1.The morphology of hippocampal neurons of rats in each group was observed by HE staining. The scale bar=50 μm.

图1 各组大鼠海马神经元HE染色结果

2 丁苯酞抑制AD大鼠海马神经元凋亡

与对照组相比，模型组海马神经元的凋亡率及Bax和cleaved caspase-3蛋白表达水平均显著升高，而Bcl-2蛋白的表达水平明显降低(P<0.05)；与模型组相比，丁苯酞低、中和高剂量组海马神经元的凋亡率及Bax和cleaved caspase-3蛋白表达水平均显著降低，而Bcl-2蛋白的表达水平显著升高(P<0.05)；且丁苯酞中、高剂量组的作用显著大于低剂量组(P<0.05)，而丁苯酞中、高剂量组间的作用无显著差异(P>0.05),见图2。

3 丁苯酞对SIRT1/NF-κB信号通路的影响

Western blot进一步检测海马组织中SIRT1/NF-κB信号通路相关蛋白SIRT1、p-NF-κB p65和p-IκBα的表达情况，结果显示，与对照组相比，模型组中SIRT1蛋白表达显著降低，而p-NF-κB p65和p-IκBα蛋白表达显著升高(P<0.05)；丁苯酞低、中和高剂量组中SIRT1蛋白表达较模型组显著升高，而p-NF-κB p65和p-IκBα蛋白表达显著低于模型组(P<0.05)，见图3。

4 激活SIRT1/NF-κB信号通路抑制海马神经元凋亡

与模型组相比，给予SIRT1激动剂SRT1720处理后，SIRT1表达显著升高，而p-NF-κB p65和p-IκBα的表达显著降低(P<0.05);SRT1720组细胞凋亡率较模型组显著降低(P<0.05)；SRT1720组细胞中Bcl-2蛋白表达水平显著高于模型组，而Bax和cleaved caspase-3蛋白表达水平显著低于模型组(P<0.05)，见图4。

Figure 2.Effect of butylphthalide (NBP) on apoptosis of hippocampal neurons in AD rats. A：the apoptosis rate of each group was detected by flow cytometry; B：the protein expression of Bcl-2, Bax and cleaved caspase-3 was detected by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsmodel group;&P<0.05vsNBP-L group.

图2 丁苯酞对AD大鼠海马神经元凋亡的影响

Figure 3.Effect of butylphthalide (NBP) on the expression of SIRT1/NF-κB signaling pathway related proteins. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsmodel group;&P<0.05vsNBP-L group.

图3 丁苯酞对SIRT1/NF-κB信号通路相关蛋白表达的影响

5 抑制SIRT1/NF-κB信号通路促进海马神经元凋亡

与模型组相比，给予SIRT1抑制剂sirtinol处理的大鼠海马组织中SIRT1和Bcl-2蛋白表达显著降低，而p-NF-κB p65、p-IκBα、Bax和cleaved caspase-3蛋白的表达水平及细胞凋亡率显著升高(P<0.05)，见图5。

6 丁苯酞通过调控SIRT1/NF-κB信号通路抑制海马神经元凋亡

与模型组相比，给予50 mg/kg丁苯酞处理后，细胞凋亡率及Bax和cleaved caspase-3蛋白表达水平显著降低，而Bcl-2蛋白表达水平显著升高(P<0.05)；而给予SIRT1抑制剂sirtinol处理后，丁苯酞对海马神经元凋亡和Bax、cleaved caspase-3蛋白表达的抑制作用及对Bcl-2蛋白表达的促进作用均显著减弱(P<0.05)，见图6。

讨 论

丁苯酞具有较好的神经保护作用，其可通过激活Nrf2-ARE途径增加抗氧化酶活性并减轻神经功能缺损、脑含水量和皮质神经元凋亡引起的脑损伤[10]；通过激活Akt/mTOR信号抑制神经元凋亡和自噬，改善反复脑缺血再灌注损伤小鼠的认知损伤[11]，还可通过p38 MAPK通路抑制海马神经元凋亡进而改善血管性痴呆大鼠的学习记忆能力[12]。SIRT1是一种依赖于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的组蛋白去乙酰化酶，广泛表达于成熟组织中，可通过去乙酰化作用调控基因表达，在抗炎、抗氧化应激和抗凋亡等生理病理过程中发挥着重要作用[13-15]。在AD病变过程中，SIRT1可通过抑制NF-κB信号通路或增强α-分泌酶的活性减少β-淀粉样蛋白的病理沉积；其激活可改善脑室注射链脲酶素导致的海马区认知障碍，发挥神经保护作用，被认为是预防和改善AD的重要靶基因[16]。研究证实[7,9,17]，丁苯酞可通过上调Bcl-2，并下调Bax和caspase-3的表达抑制AD大鼠海马神经元凋亡；SIRT1可通过抑制NF-κB活性减少神经元凋亡，丁苯酞可通过上调SIRT1表达抑制海马神经元凋亡，减轻大鼠脑缺血再灌注损伤；但丁苯酞是否通过激活SIRT1/NF-κB途径发挥抑制海马神经元凋亡进而改善AD神经损伤尚需充分认识。

Figure 4.Effect of activation of SIRT1/NF-κB signaling pathway on apoptosis of hippocampal neurons. A: the protein expression of SIRT1, p-NF-κB p65 and p-IκBα was detected by Westem blot; B: the apoptosis rate was detected by flow cytometry; C: the protein expression of Bcl-2, Bax and cleaved caspase-3 was detected by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsmodel group.

图4 激活SIRT1/NF-κB信号通路对海马神经元凋亡的影响

Figure 5.Effects of inhibiting SIRT1/NF-κB signaling pathway on apoptosis of hippocampal neurons. A: the protein expression of SIRT1, p-NF-κB p65 and p-IκBα was detected by Westem blot; B: the apoptosis rate was detected by flow cytometry; C:the protein expression of Bcl-2, Bax and cleaved caspase-3 was detected by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsmodel group.

图5 抑制SIRT1/NF-κB信号通路对海马神经元凋亡的影响

Figure 6.Effects of butylphthalide (NBP) on apoptosis of hippocampal neurons regulated by SIRT1/NF-κB signaling pathway. A: the apoptosis rate was detected by flow cytometry; B: the protein expression of Bcl-2,Bax and cleaved caspase-3 was detected by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsmodel group;&P<0.05vsNBP-M+ddH2O group.

图6 丁苯酞调控SIRT1/NF-κB信号通路对海马神经元凋亡的影响

腹腔注射D-半乳糖联合AlCl3灌胃是构建AD大鼠模型常用方法[18-20]。我们采用上述方法造模并给予丁苯酞作用后，HE染色检测模型组神经元较对照组出现了严重缺失和核固缩等病理改变；而给予丁苯酞处理的大鼠海马组织中神经元的病理变化较模型组有显著改善；流式细胞术和Western blot检测到丁苯酞可抑制AD大鼠模型中海马神经元凋亡率及凋亡相关蛋白Bax和cleaved caspase-3的表达，而上调Bcl-2的表达，这一结果与文献报道的结果相吻合[9]。Western blot进一步检测丁苯酞可上调AD大鼠模型中SIRT1蛋白表达，下调p-NF-κB p65和p-IκBα蛋白表达，提示SIRT1/NF-κB信号通路在丁苯酞改善AD神经损伤过程中发挥着重要作用。以SIRT1激活剂SRT1720上调SIRT1表达并抑制NF-κB活性后，观察到海马神经元的凋亡率显著降低，同时Bax和cleaved caspase-3表达受到抑制，而Bcl-2表达增强；而以SIRT1抑制剂sirtinol作用后得到与之相反的结果，这一结果与研究报道的上调SIRT1表达可通过上调Bcl-2表达，下调Bax表达及caspase-3活性抑制骨关节炎软骨细胞凋亡的机制相一致[21]。同时观察到sirtinol可显著减弱丁苯酞对海马神经元凋亡和Bax和cleaved caspase-3蛋白表达的抑制作用,及对Bcl-2蛋白表达的促进作用，这一结果提示，丁苯酞可通过SIRT1/NF-κB途径上调Bcl-2，并下调Bax和cleaved caspase-3蛋白表达抑制海马神经元凋亡。

综上所述，SIRT1/NF-κB信号通路在AD海马神经元凋亡过程中发挥着重要作用，激活SIRT1/NF-κB信号通路,下调Bax和cleaved caspase-3,并上调Bcl-2蛋白的表达可能是丁苯酞抑制海马神经元凋亡的机制之一。