超声实时剪切波弹性成像技术评估兔非酒精性脂肪性肝病的实验研究

黄朝霞 段庆红 焦俊 雷平贵 廖洪勇 罗艳

非酒精性脂肪性肝病 （nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）是一类以肝细胞内脂肪堆积为特征、除外乙醇和其他明确肝损因素所致的疾病，包含不同程度的肝脏损害，从非酒精性单纯性脂肪肝（simple steatosis，SS）到非酒精性脂肪性肝炎（nonalcoholic steatohepatitis，NASH），终末期还可能发展为肝硬化及肝细胞癌[1]。虽然SS是相对良性的病变，但30%的SS会进展为NASH，而NASH作为隐源性肝硬化的一个重要因素，可发展为肝硬化或肝细胞癌[2]。长期以来，绝大多数研究主要集中在病毒性肝炎和肝纤维化方面，对NAFLD及肝纤维化报道较少，且绝大部分未涉及NASH的诊断，而早期准确诊断和治疗NASH有利于采取适当的临床干预和治疗措施，改善肝纤维化和预防肝硬化。肝活检至今仍是区分SS与NASH以及判断NAFLD严重程度的唯一方法，但临床应用中受到诸多限制，而剪切波弹性成像（shear wave elastography，SWE）监测肝脏弹性的可重复性及一致性较好[3-4]，国内外应用SWE评估肝纤维化的报道众多。但是，应用SWE定量诊断NAFLD的研究报道较少，应用SWE对NAFLD所处的疾病阶段进行无创性实时评估，国内尚处于起步阶段。本研究旨在应用SWE技术对NAFLD兔肝脏进行检测，并以病理结果作为金标准，探讨SWE技术在评估NAFLD中的应用价值。

1 材料与方法

1.1 模型制备 8周龄新西兰大白兔60只，无性别限制，由贵州医科大学实验动物中心提供[质量合格证号：SCXK（黔）2012-0001]。 60 只兔随机分为5组（每组12只）以制作正常及不同阶段的NAFLD模型。第1组为对照组，采用普通饲料喂养8周；第2～5组为实验组，采用高脂高胆固醇饲料（2%胆固醇＋6%蛋黄粉＋2%麦芽糊精＋10%猪油＋80%普通饲料）喂养，喂养时间分别为 2、4、8、12周。 本研究经本院动物使用与保护委员会批准。

1.2 SWE检查 采用法国Supersonic Imagine公司的AixPlorer型ShearWaveTM实时剪切波弹性超声诊断仪，SL15-4探头，频率4～15 MHz。经兔耳缘静脉注射3%戊巴比妥钠进行麻醉，剂量为1 mL/kg体质量。灰阶超声观察肝脏大小、形态、包膜及回声，切换到SWE模式，调节取样框边长为10～15 mm，避开肝内血管、胆管等结构，冻结图像并启用Q-BOX功能，设定Q-BOX的直径为8 mm，系统自动计算出肝脏的弹性模量平均值、最小值及最大值。每只兔取5处兴趣区进行测量，包括纵切门静脉主干时，门静脉近场肝组织；纵切第一肝门门静脉入肝段，其一级分支两侧肝组织；纵切肝中静脉汇入下腔段，肝中静脉左右两侧肝组织，每个兴趣区均重复测量3次后取平均值。

1.3 病理学分组 经空气栓塞法处死兔，取肝右叶、肝左外叶及左内叶进行苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）和马松染色（Masson’s trichrome，MT）处理。采用LEICA DM 2500显微镜观察肝脏病理组织学改变。参考Kleiner等[5]的方法对每只兔进行 NAFLD 活动评分（NAFLD activity score，NAS）[0～8分，评价肝细胞脂肪变性（0～3分）、小叶内炎症（0～3 分）及肝细胞气球样变（0～2 分）]。 当 3 处肝组织评分结果不一致时，以最高评分为最终结果。依据NAS评分将兔分为正常组（NAS=0）、SS组（NAS=1，2）、交界组（NAS=3，4）和 NASH 组（NAS≥5）。 光镜下观察兔肝纤维化程度并进行肝纤维化分期，S0期：无肝纤维化；S1期：中央静脉周围、窦周或门静脉周围纤维化；S2期：中央静脉周围和门静脉周围纤维化；S3期：桥接纤维化和结节；S4期：肝硬化。

1.4 统计学分析 使用SPSS 22.0软件进行数据分析处理。符合正态分布的计量资料用均数±标准差）表示，不符合正态分布时用中位数（四分位数间距）[M（P25，P75）]表示。 采用 Kruskal-Wallis检验评估NAFLD不同病理分组及肝纤维化不同病理分期间肝脏弹性模量值的差异，如果P＜0.05，则进一步用Kruskal-Wallis成对比较进行多组间两两比较。绘制受试者操作特征（ROC）曲线并计算曲线下面积（AUC），评价SWE对NAFLD及肝纤维化的诊断效能，取敏感度和特异度之和最大时为最佳截断值，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 病理学分组及分期 实验结束后共54只兔存活。其中，正常组11只、SS组8只、交界组19只、NASH组16只。肝纤维化分期中，S0期32只、S1期7只、S2期 9只、S3期 6只。

2.2 SWE对NAFLD的评估效果

2.2.1 弹性模量值比较 正常组、SS组、交界组及NASH组间弹性模量平均值、最小值、最大值总体差异均具有统计学意义（均P＜0.05）。随着NAFLD严重程度进展，弹性模量平均值、最大值呈上升趋势，NASH组中弹性模量平均值、最小值、最大值均高于正常组（均P＜0.05），其余3组间弹性模量值差异均无统计学意义（P＞0.05）（图 1，表 1）。

2.2.2 ROC曲线分析 弹性模量平均值诊断NAFLD（≥SS组）的界值为6.42 kPa，AUC为0.759,诊断敏感度和特异度为60.5%、100%；对SS组与NASH组的鉴别界值为 8.64 kPa时，AUC最大（0.969），诊断敏感度和特异度为93.8%、87.5%。详见表2。

2.3 SWE对肝纤维化的评估

图1 不同NAFLD分组的SWE图。A图为正常组；B图为SS组；C图为交界组；D图为NASH组。

2.3.1 弹性模量值的比较 不同肝纤维化病理分期间弹性模量平均值、最小值、最大值总体差异具有统计学意义（均P＜0.05）。随着肝纤维化严重程度的进展，弹性模量平均值、最小值及最大值均呈上升趋势。S3期弹性模量平均值、最小值及最大值均高于S0期（均P＜0.05）；S2期弹性模量平均值和最大值均高于S0期（均P＜0.05）；其余组间弹性模量值差异均无统计学意义（P＞0.05）（表 3）。

表1 不同NAFLD分组间弹性模量值的比较kPa

2.3.2 ROC曲线分析 弹性模量平均值、最小值、最大值诊断肝纤维化不同病理分期的AUC均>0.7，其中以弹性模量平均值的AUC最大。以弹性模量平均值≥6.53 kPa诊断≥S1期肝纤维化、≥8.30 kPa诊断≥S2期肝纤维化、≥12.38 kPa诊断S3期肝纤维化，AUC 分别为 0.910、0.961、0.974， 敏感度分别为90.9%、100%、100%，特异度分别为84.4%、82.1%、89.6%（表 4）。

表2 NAFLD不同病理分组之间的弹性模量值的诊断价值

表3 不同分期肝纤维化的弹性模量值比较kPa

表4 SWE弹性模量值对不同肝纤维化分期的诊断价值

3 讨论

脂肪肝是指肝细胞内脂肪蓄积量异常，NAFLD是其最常见的病因[6]。NASH是NAFLD病程进展的关键环节。在NAFLD病人中，仅NASH病人可发展为严重的肝硬化和肝癌，因此临床及早有效鉴别SS和NASH具有重要意义[1]。近年来，随着NAFLD发病率逐年上升，国内外研究者对其无创性诊断展开研究。目前，超声弹性成像技术已被用于肝脏弥漫性病变的诊断[7]。SWE是临床上最新的超声弹性成像技术，不仅可以在二维影像的基础上进行弹性成像，还可定量测量设定区域内组织的弹性模量值[8]。从理论上讲，组织的硬度取决于分子微细结构和胶原蛋白含量的变化，NAFLD随着肝细胞的不断损伤，逐渐发生变性、坏死、再生以及纤维结缔组织增生，形成肝纤维化。肝纤维化的病理基础是细胞外基质的过度沉积，胶原含量也明显增加，导致肝组织逐渐变硬，继而可反映在肝脏弹性值的测量上[9]。因此，本研究中应用SWE技术所测得肝组织弹性值来评估NAFLD的病变程度是受到理论支持的。根据Fu等[10]研究，兔在采用高脂高胆固醇饲料喂养8周后发生了NASH，而Joo等[11]喂以同样的高脂高胆固醇饲料，1周后成功获得兔SS模型。因此本研究对实验组兔喂养时间分别设定为2、4、8、12周，以达到不同阶段的NAFLD。

3.1 SWE评估NAFLD 本研究结果显示，弹性模量平均值随着NAFLD严重程度进展呈增高的趋势，NASH组的弹性模量平均值明显高于正常组、SS组及交界组（均P＜0.05），而正常组、SS组及交界组间两两比较，弹性模量平均值差异均无统计学意义（P＞0.05）。Lu等[12]分别采用高脂饮食和乙醇喂养大白兔以建立NAFLD模型和酒精性脂肪肝模型，使用SWE评估不同模型组兔的肝脏硬度，结果显示NAFLD组兔的肝脏硬度增大，SWE所测得的弹性模量平均值、最大值较正常组明显升高（P＜0.05）。贺等[13]分别在16周、24周应用SWE检测高脂喂养组家兔和对照组家兔的肝组织硬度值，发现高脂组家兔肝脏硬度值显著大于对照组，且高脂组家兔24周的肝组织硬度值高于16周，差异均具有统计学意义（P＜0.05）。 吴等[14]采用SWE技术监测 NAFLD大耳白兔在不同时间段的肝硬度，研究结果与贺等研究结果一致。但上述研究均仅分析了NAFLD组与正常组肝脏弹性模量值的差异，并未涉及到包括SS、NASH在内的NAFLD严重程度的具体分期。而Kang等[15]在对56只NAFLD大鼠的研究中发现，SWE技术可有效检测NASH和肝纤维化分期；不同分期的NAFLD其弹性模量平均值具有显著差异，NASH 组[（7.2±1.9） kPa]和肝硬化组[（18.8±2.0） kPa]高于正常组[（5.4±0.3） kPa]、SS 组[（5.5±0.3） kPa]、交界组[（5.4±0.4） kPa]，其差异有统计学意义（P＜0.05），而正常组、SS组和交界组弹性模量平均值差异无统计学意义。本研究结果与Kang等[15]研究结果一致，分析认为是由于NASH组兔发生了不同程度肝纤维化，导致肝组织硬度增大，因而测得的弹性模量平均值升高。此外，本实验还研究了弹性模量最小值及最大值在NAFLD不同病理分期中的变化，结果显示NASH组弹性模量最小值及最大值均明显高于正常组，差异有统计学意义（均P＜0.05）。因此，弹性模量最小值及最大值在评估NAFLD分期中也具有一定价值。

国内郭等[16]采用声辐射力脉冲成像技术评估NAFLD严重程度，发现该技术能对NAFLD进行有效诊断，且在辨别SS组和NASH组中具有较高的诊断效能，ROC曲线的AUC为0.882，对应的敏感度和特异度均高于80%。本实验的ROC曲线分析显示，以弹性模量平均值为6.42 kPa诊断NAFLD（≥SS组）、8.64 kPa鉴别SS组与 NASH组的 AUC分别为0.759、0.969，敏感度为 60.5%、93.8%，特异度为100%、87.5%。表明SWE可较为准确地诊断NAFLD，且能有效检出NASH。

3.2 SWE评估NAFLD纤维化 本研究采用SWE技术评估NAFLD兔肝纤维化的严重程度，结果显示肝脏弹性模量平均值、最小值及最大值均随着肝纤维化严重程度的进展而升高，S3期明显高于S0期，差异具有统计学意义（均 P＜0.05）。 与吴等[14]、孙等[17]研究结果一致。这是由于肝内纤维结缔组织随着肝纤维化程度进展不断增生，胶原纤维和网状纤维也随之增多，范围逐渐扩大，继而导致肝组织硬度增加，SWE 测值升高。而 S0与 S1、S1与 S2、S1与 S3、S2与S3之间两两比较，弹性模量平均值、最小值及最大值差异均无统计学意义（P＞0.05）。该结果表明SWE虽能有效诊断S2、S3期肝纤维化，但对肝纤维化各期的辨别能力有限。通过绘制ROC曲线，发现对于辨别肝纤维化不同分期，弹性模量平均值的AUC最大。以弹性模量平均值为6.53、8.30、12.38 kPa分别诊断肝纤维化≥S1期、≥S2期和S3期，所对应的AUC 分别为 0.910、0.961、0.974，相应的敏感度和特异度均大于82%。然而，上述诊断界值及相应AUC与既往研究报道[12-13，17]存在差异。考虑原因，首先可能是由于研究对象及造模方法不统一；其次，可能是由于样本量及样本量的分配不同，本研究样本量总体偏少，且肝纤维化程度以轻中度为主，无肝硬化病例；再者，也可能是由于各研究SWE检测方法、部位及病理检测方法、条件及分期标准有差异。

综上，本研究结果表明SWE可较为准确地诊断NAFLD及含有NAFLD的肝纤维化，能有效区分SS和NASH。

3.3 局限性 ①本研究样本量总体偏少，分析得出的数据代表性不佳；②兔肝脏SWE的测量部位不完全一致，且可能会受到生理运动如呼吸和心脏搏动的影响，尽管已经通过测量颜色均一区域和重复测量来尽可能减小误差；③本研究没有完全做到SWE成像-组织学共定位，这可能会影响实验结果，特别是对于具有局部异质性肝脏弹性分布的特殊病例。