100种中草药对无乳链球菌和海豚链球菌体外抑杀研究

崔淼, 刘茹, 张辉杰, 叶长鹏, 许德麟, 张其中

100种中草药对无乳链球菌和海豚链球菌体外抑杀研究

崔淼, 刘茹, 张辉杰, 叶长鹏, 许德麟, 张其中*

暨南大学水生生物研究所, 广东省高校水体富营养化与赤潮防治重点实验室, 广州 510632

无乳链球菌()和海豚链球菌()给罗非鱼(sp.)养殖带来了严重的经济损失, 而抗生素等药物的使用会造成细菌的耐药性和环境污染, 因此, 研究了100种中草药对罗非鱼链球菌体外抑杀效果, 以筛选出替代抗生素的绿色中草药。其中16种中草药具有较好的抑菌作用, 但将其pH 值调至7.0±0.04后, 大部分中草药的抑菌效果会显著下降(<0.01), 只有桑白皮()、藿香()、豨莶草()、槐角()的抑菌效果比较明显。将pH 值调至7.0±0.04后, 采用二倍梯度稀释法测定这4种中草药的最低抑菌浓度(Minimal Inhibitory Concentration,MIC)和最小杀菌浓度(Minimal Bactericidal Concentration,MBC), 结果显示, 桑白皮抑杀无乳链球菌的效果最好, MIC和MBC均为0.3906 mg·mL-1; 豨莶草抑杀无乳链球菌的效果次之, MIC为0.3906 mg·mL-1, MBC为0.7813 mg·mL-1; 藿香、豨莶草、槐角抑杀海豚链球菌的效果最好, MIC和MBC均为0.3906 mg·mL-1。

中草药; 无乳链球菌; 海豚链球菌; 最低抑菌浓度; 最小杀菌浓度

0 前言

由无乳链球菌()和海豚链球菌()引起的罗非鱼链球菌病[1], 给罗非鱼养殖业带来了严重的损失[2], 因此, 罗非鱼链球菌病的生态防治是一个重要的研究课题。无乳链球菌和海豚链球菌都是革兰氏阳性球菌, 也是人畜共患的致病菌, 对人体和养殖罗非鱼都有危害。目前在罗非鱼养殖中, 主要利用抗生素等化学药物对链球菌病进行防治, 但长时间的化学防治不仅会诱导出耐药菌株, 降低治疗效果, 同时也会对生态环境产生不良的影响。而中草药含有的次级代谢复合物, 具有抗病菌、不易诱导出耐药菌株、毒副作用小、不易残留等优点, 是一种环保型的抗生素替代物[3], 具有很好的开发利用价值。另外, 中草药还可以作为一种免疫增强剂, 增强鱼体对外界致病菌的抵抗力[4]。已有研究表明, 不同中草药抑杀水产致病菌的效果存在较大的差异, 因此, 筛选出对无乳链球菌和海豚链球菌具有较好抑杀效果的中草药, 具有重要的现实意义。本文研究了100种中草药对罗非鱼无乳链球菌和海豚链球菌的体外抑杀效果, 研究结果将为罗非鱼链球菌病的生态防控提供重要的参考资料。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验菌株

无乳链球菌ATCC13813、海豚链球菌ATCC 29178均为中国水产科学研究院珠江水产研究所惠赠并保存。

1.1.2 中草药物

100种中草药从广州市天河区石牌佰康源大药房购得: 夹竹桃()根、茎; 牵牛子()成熟果实; 牛心朴子()根、茎; 川谷()核; 蝙蝠葛()根; 北沙参()根; 莨菪籽()种子; 黄花烟草()全株; 木鳖子()种子; 千金子()种子; 雷丸()核; 阿魏()树脂; 大风子()成熟种子; 辣椒()成熟种子; 滨蒿()地上部分; 地锦草()全部; 佛手()果实; 槐角()干燥花及花蕾、成熟果实; 积壳()成熟果实; 罗布麻()干燥根; 刺毛黧豆()果实; 大蒜()鳞茎; 洋甘菊()花蕾; 响铃草()全草; 茶条槭()叶、芽; 桉叶()叶; 百里香()全草; 岩椒草()全草; 羊角藤()根或根皮; 斩龙剑()全草; 枳壳()果实; 梓木草()全草; 相思子()果实; 缬草()根及根茎; 望江南子()种子; 无爷藤()全草; 乌毛蕨()根茎; 水线草()全草; 松萝()地衣体; 石楠()叶、根; 青风藤()藤茎; 牛筋果()叶; 猫须草()茎、叶; 爵床()全草; 苦石莲()根、茎、叶、种仁; 蛇舌草()全草; 墨旱莲()全草; 威灵草()根茎; 藿香()茎枝; 海金沙()孢子; 桑白皮()根皮; 麦冬()根; 沙棘()果实; 赤小豆()果实; 瓜蒌子()种子; 豨莶草()地上部分; 藁本()根茎; 白茅根()根茎; 水牛角()犀角; 金荞麦()根茎; 木榧子()成熟果实; 火麻仁()种子; 千里光()地上部分; 北鹤虱()果实; 鸦胆子()成熟果实; 黄参()根; 马勃()实体; 炉甘石()矿物; 九节茶()枝叶; 生地黄()块根; 大血藤()藤茎; 槐花()花蕾及花; 女贞子()果实; 萹蓄()茎、叶混样; 樟脑()结晶; 苦楝()根皮、树皮; 乌药()根; 锁阳()肉质茎; 莪术()茎陀; 侧柏()枝梢和叶; 石楠藤()枝叶; 山栀()果实; 苦丁()叶; 青黛()茎或叶; 商路()根; 狗脊()根茎; 鸡冠花()花; 老鹳草()全草; 川乌()根; 积雪草()全草; 鸡骨草()全株; 路路通()果实; 金钱草()干燥全草; 紫荆花()花; 黄连()根茎; 诃子()果实; 布渣叶()叶; 小通草()茎髓; 丝瓜络()果实; 浮小麦()果实。

1.1.3 培养基

脑心浸萃液体培养基(BHI)37 g, 超纯水1000 mL, 高温高压(121 ℃, 0.5 MPa, 20 min)灭菌。固体培养基是在液体培养基中加琼脂粉(13 g·L-1)。

1.2 方法

1.2.1 菌液的制备

将无乳链球菌和海豚链球菌分别接种于BHI液体培养基中, 在28 ℃恒温摇床中(200 r·min–1)培养24 h, 再用平板计数法计数, 并用液体培养基将菌液稀释至1×107cfu·mL–1, 存于4 ℃冰箱内备用。

1.2.2 中草药的制备

将100种中草药烘干粉碎后各称取20 g, 加入450 mL乙醇(100%)过夜浸泡, 浓缩、干燥后调浓度为0.2 μg·mL-1, 存于4 ℃冰箱内备用。

1.2.3 体外抑菌研究

用琼脂扩散法[5]测定100种中草药物抑杀无乳链球菌和海豚链球菌的效果。即首先用移液器取100 μL的菌液于BHI固体培养基上, 用涂布棒涂布均匀后静置至无液体流动, 然后用6 mm的打孔器在上面均匀打出四个孔。在一个孔中加入30 μL的乙醇作为对照孔, 其余三个孔中各加入等量的中草药液, 用封口膜封口后放于28 ℃恒温培养箱中培养24个小时, 之后用游标卡尺测量并记录抑菌圈直径。选取有效抑菌的中草药物, 测定其原始pH值后, 通过边滴加稀释配制的5 mol·L-1的氢氧化钠溶液, 边测定中草药液的pH值, 将其pH值调至7.0左右(7.0±0.04), 再测量其抑菌直径。中草药抑菌效果的标准为: 抑菌圈直径≥20 mm 为强抑菌作用; 15 mm— 20 mm为中等抑菌作用; 10 mm—15 mm 为弱抑菌作用; <10 mm 为无抑菌作用[6]。

1.2.4 最低抑菌浓度(Minimum Inhibitory Concen­tration, MIC)

比较并选取调pH值至7.0±0.04后, 能有效抑菌的中草药物, 用二倍梯度稀释法[7]测定其最低抑菌浓度(MIC值)和最小杀菌浓度(MBC值)。选用的中草药各为一组, 每组取11支试管并进行编号, 向编号1的试管中加入液体培养基740 µL和中草药提取物60 µL, 再向其余各管中加入液体培养基800 μL, 各管充分混匀后, 用移液器取1号试管中的混合液800 μL于2号试管中, 再次充分混匀。以此重复, 吸取最后一支试管中的800 μL丢弃, 再向各管中加入菌液各200 μL。另向对照管1中加入1 mL的液体培养基, 对照管2中加入800 μL的液体培养基和200 μL的菌液。然后置于28 ℃恒温摇床中震荡培养24 h, 混匀后吸取100 μL培养液涂布在相应的培养基上, 再置于28 ℃恒温培养箱中24 h, 观察各培养基上无菌生长的最高稀释管所对应的药物浓度即是最低抑菌浓度(MIC)。

1.2.5 最小杀菌浓度(Minimum Bactericidal Concen­tration, MBC)

在测定最低抑菌浓度MIC的试验基础上再培养24 h, 无菌生长的最高稀释浓度为最小杀菌浓度MBC。之后进行验证, 即取MBC和更高稀释浓度各100 μL, 涂布在相应培养基上于28 ℃恒温培养箱中24 h, 此时MBC所对应的培养基无菌生长即验证正确, 否则失败需要重新测定。

1.2.6 数据处理方法

用SPSS 22.0的成对样本T检验(Paired-Samples T Test)分析数据, 其检验水平是0.01<<0.05为差异显著,<0.01为差异极显著。

2 结果与分析

2.1 100种中草药物的抑菌效果

测定的100种中草药物中能有效抑菌的中草药有16种(表1)。其中有效抑制无乳链球菌的中草药物有3种, 效果最好的分别为黄连()、积壳()、桑白皮(); 有效抑制海豚链球菌的中草药物有6种, 效果最好的分别为槐角()、藿香()、豨莶草()、桑白皮()、槐花()、诃子()。将中草药提取物pH值调至7.0±0.04后, 其抑菌效果均显著性减弱(<0.05)或极显著性减弱(<0.01) (表1)。

表1 16种中草药对无乳链球菌和海豚链球菌的抑菌效果

注: *表示调节药液pH前后抑菌圈直径差异显著, 0.01<<0.05; **表示调节药液pH前后抑菌圈直径差异极显著,<0.01。抑菌圈直径用平均数(Mean)和方差(SD)表示。

2.2 最低抑菌浓度和最小杀菌浓度

根据调pH值前后的抑菌效果挑选出4种抑菌效果好的中草药, 用二倍梯度稀释法测得其对两种链球菌的最低抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC), 结果如表2所示。将中草药提取物pH值调至7.0± 0.04后, 桑白皮抑杀无乳链球菌的效果最好, MIC和MBC均为0.3906 mg·mL-1; 豨莶草抑杀无乳链球菌的效果次于桑白皮, 其MIC为0.3906 mg·mL-1, MBC为0.7813 mg·mL-1; 藿香和槐角抑杀无乳链球菌的效果次于豨莶草, 其MIC和MBC均为0.7813 mg·mL-1。而藿香、豨莶草、槐角抑杀海豚链球菌的效果最好, 其MIC和MBC均为0.3906 mg·mL-1;桑白皮抑杀海豚链球菌的效果次于藿香、豨莶草、槐角, 其MIC为0.3906 mg·mL-1, MBC为0.7813 mg·mL-1。

3 结论与讨论

100种中草药提取物的初始pH值在4.07—6.84之间, 药液呈酸性, 但调pH值至7.0±0.04后, 结果显示部分中草药物的抑菌效果减弱, 这与陈辉[8]和华亚南[9]研究的中草药体外抑菌结论相符。推测其原因可能是: 无乳链球菌和海豚链球菌都是革兰氏阳性菌, 其适宜生长在pH值为7—8的环境中[10], 而中草药初始提取物的酸性性质, 则抑制了无乳链球菌和海豚链球菌的生长繁殖[11]。因此将中草药物的pH值调至7.0±0.04, 可以避免中草药物的酸性性质带来的干扰[12]。将中草药物的pH值调至7.0±0.04后, 能更加准确而有效地筛选出抑菌效果强的中草药。

无乳链球菌和海豚链球菌是罗非鱼的主要致病菌, 本文比较了100种中草药对两种病原菌的抑菌圈直径, 其中桑白皮、藿香、槐角和豨莶草对两种罗非鱼链球菌均有明显的抑杀效果。有研究显示, 补骨脂、博落回、五倍子、三颗针、紫草、田七须等中草药物对无乳链球菌和海豚链球菌均有较好的抑杀作用[13], 这是否表明它们抑杀两种链球菌的中草药活性成分具有相同或相似性, 有待进一步深入研究。本研究结果显示, 桑白皮和豨莶草对无乳链球菌的抑杀效果最佳, 藿香、槐角、豨莶草对海豚链球菌的抑杀效果最佳。实验数据表明抑杀两种罗非鱼链球菌的最佳中草药有一定的差异, 推测此可能与不同中草药本身含有的不同的抑菌成分有关。

桑白皮提取物中含有多糖、黄酮、甾醇等中草药成分, 已有研究显示桑白皮提取物甾醇对大肠杆菌有一定的抑杀作用[14], 本研究的桑白皮乙醇提取物对无乳链球菌的抑杀效果最佳, 但目前对桑白皮的抑菌成分研究还较少, 尚需进一步研究其抑菌机理及机制。豨莶草抑杀无乳链球菌的效果仅次于桑白皮, 其主要抑菌活性成分是二萜类和苷类, 豨莶草的甲醇提取物能抑杀金黄色葡萄球菌, 可以特异性地抑杀革兰氏阳性菌[15], 而无乳链球菌和海豚链球菌都是兼性厌氧型的革兰氏阳性菌, 这也就解释了豨莶草醇提物对无乳链球菌和海豚链球菌均能有效抑杀的原因。藿香提取物中的主要成分含有甲基胡椒酚、烯、醇、酮等, 可以有效抑制蜡样芽孢杆菌和变形链球菌[16], 这些活性成分类似于细胞膜上的磷脂双分子层结构, 根据相似相溶原理, 其胞内物质很容易外泄而造成细菌死亡[17], 本研究结果表明, 藿香对无乳链球菌的抑杀效果最佳。槐角的乙醇提取物中主要含有黄酮, 其在pH值为7.0左右的条件下可以破坏细菌的细胞结构, 使胞内物质泄出而造成细胞代谢紊乱, 从而抑制细菌的生长繁殖[18-19],因此槐角的醇提物也可以有效抑杀海豚链球菌。

不同中草药含有的抗菌物质不同, 其抑菌机理也各有差异, 每种中草药对不同细菌的抑菌效果也不尽相同, 因此需要通过试验筛选出抑菌效果最佳的中草药。已有研究表明, 不同中草药物含有的不同抑菌成分可以共存以形成协同效应, 从而增强抑杀致病菌的作用[20], 这就需要进行复方筛选试验以优化抗菌中草药的防治效果。利用绿色环保的中草药物可以代替抗生素等化学药物有效抑菌, 实验结果表明, 中草药提取物在体外表现出明显的抑菌作用, 但中草药是否可以直接应用于实际的水产养殖, 还需要进行体内抑菌试验。中草药物的抑菌成分在实际应用中会受到环境因素和生物体因素的影响, 因此中草药物的开发还需要进一步试验研究。

表2 四种中草药对无乳链球菌和海豚链球菌的最低抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)

中草药的抑菌效果好、绿色环保, 可以被开发为绿色生态渔药, 具有较好的应用前景。通过100种中草药的体外抑菌试验, 探究了抑杀无乳链球菌和海豚链球菌的不同中草药效果, 为筛选出有效抑杀无乳链球菌和海豚链球菌的中草药提供了重要的参考资料。

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Efficacy of 100 Chinese herbal medicines againstandin vitro

CUI Miao, LIU Ru, ZHANG Huijie, YE Changpeng, XU Delin, ZHANG Qizhong*

Institute of Hydrobiology,Jinan University, Key Laboratory of Eutrophication and Red Tide Prevention of Guangdong Higher Education Institutes, Guangzhou 510632, China

With the development of selective and intensive culture, tilapia have been reported to be severely infected by pathogenicand. The resultant streptococcosis outbreak is one of the key fish diseases with high mortality rates, and results in severe economic losses as high as ten billion dollars annually. Chinese herbal medicines have been widely acknowledged as a promising strategy owing to multiple advantages in environment, ecology and safety aspects. In this study, extracts of 16 Chinese herbal medicines were discovered to show anti-Streptococcus activities in vitro, after the pH values were adjusted to 7.0±0.04, the antibacterial effect of most Chinese herbal medicines decreased significantly (<0.01), only,,,, which had well antibacterial efficacy.had the best effect against, with the minimal inhibitory concentration (MIC) and the minimal bactericidal concentration (MBC) of 0.3906 mg·mL-1. The efficacy ofagainstwas second, with MIC of 0.3906 mg·mL-1and MBC of 0.7813 mg·mL-1;,,had the best efficacy against, with both MIC and MBC of 0.3906 mg·mL-1.

Chinese herbal medicine;;; Minimum Inhibitory Concentration (MIC); Minimum Bactericidal Concentration (MBC)

10.14108/j.cnki.1008-8873.2019.04.011

Q939.1

A

1008-8873(2019)04-071-06

2019-05-17;

0000-00-00

广州市科技计划项目产学研协同创新重大专项民生科技专题 (201604020029, 201804010494); 广东省海洋与渔业厅科技项目 (A201601B05, SDYY-2018-08)

崔淼(1979—), 男, 博士, 副研究员, 主要从事水产动物免疫学研究, E-mail: cuisanshui@163.com

张其中, 男, 博士, 教授, 主要从事分子免疫学研究, E-mail: Zhangqzdr@126.com

崔淼, 刘茹, 张辉杰,等. 100种中草药对无乳链球菌和海豚链球菌体外抑杀研究[J]. 生态科学, 2019, 38(4): 71-76.

CUI Miao, LIU Ru, ZHANG Huijie, et al. Efficacy of 100 Chinese herbal medicines againstandin vitro[J]. Ecological Science, 2019, 38(4): 71-76.