ICP-OES法测定余甘子不同器官中11种微量元素①

袁建民 何 璐 杨晓琼 许智萍 赵琼玲瞿文林 雷 虓 孔维喜

(1云南省农业科学院热区生态农业研究所 云南元谋651300;2云南元谋干热河谷植物园 云南元谋651300)

余甘子（Phyllanthus emblicaL.），俗称滇橄榄，又称油甘子、回甘子、喉甘子等，因其吃起来“先苦后甜”而得名。余甘子属于大戟科叶下珠属落叶乔木或灌木，是一种十分独特的分布于热带、亚热带干热河谷地区的资源植物。余甘子原产于中国、印度、泰国、马来西亚、巴基斯坦等地，目前已引种到南非、美国、澳大利亚等地，中国和印度分布面积最大，产量最高［1]。在中国，余甘子资源相当丰富，主要分布于云南、海南、广东、广西、福建、台湾等地，其中大面积栽培以福建、广西较多，野生资源以云南最为丰富［2]。余甘子染色体组较多，2n＝104，为四倍体，是叶下珠属中少有的具核果的植物。余甘子分布于海拔80～2 300m，东经70～122°，北纬1～29°的广大地域，余甘子喜光，耐干旱，耐贫瘠，忌寒霜，对不同海拔不同生态环境具有很强的适应能力。在中国云南金沙江干热河谷区域内，分布着大面积余甘子自然野生资源，估计资源总面积为2×104hm2。余甘子营养丰富，风味独特，含有多种对人体有益的微量元素，如Fe、Mn、B、Zn、Se等元素，此外富含维生素、酚类、黄酮、氨基酸、多糖等活性物质［3]，具有抗炎抑菌［4-5]、抗肿瘤［6-8]、抗氧化［3]、降血糖［9-10]、降血压［11]、降脂［11]等药理保健作用。研究表明，余甘子整株都是宝，果实、枝叶和根茎均有很好的开发利用价值［12-13]。余甘子故被国家卫生部列入首批药食兼用名单，并被联合国卫生组织指定为全世界推广种植的3种保健植物之一，现已载入《中国药典》。

微量元素在植物的生理活动中发挥着重要作用，微量元素与人体健康同样关系密切，具有酶激活作用、宏量元素运载作用、核酸代谢作用和参与激素作用等生物功能［14]，对人体的养生保健、防病治病和延年益寿具有重要作用。因此，对余甘子不同器官中微量元素组成及含量的分析检测十分有必要。

微波消解法是近年来主流的一种样品前处理方法，是密闭式消解方法的一大进步，目前被研究人员广泛应用［15-18]。已有研究报道，元素分析测定通常采用分光光度法、原子吸收光谱法和原子荧光光谱法等，但存在检出限差、分析效率低、抗干扰能力弱等问题，而电感耦合等离子体发射光谱法（ICP-OES）具有线性范围宽（5～6个数量级）、精密度高（RSD＜1.0%）、检出限低（可至ppb级）、分析效率高、无化学干扰、多元素同时检测等优点，已成为近年来元素分析的主要手段。利用 ICP-OES 法测定枇杷［19]、含笑［20]、马缨丹［21]和蔬菜［22]等植物中的元素含量已有报道，然而利用ICP-OES法测定余甘子不同器官中多种元素的组成与含量却鲜见报道。鉴于此，本研究采用ICPOES法测定余甘子不同器官中Zn、Cd、Pb、Co、Ni、B、Mn、Fe、Cr、Mg、Cu等11种微量元素，结合微波消解法进行样品前处理，以期对余甘子微量元素组成与含量有更深入的了解，为余甘子的有效开发和综合加工利用提供数据参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试材料

供试材料为3份（编号A、B、C）不同来源地余甘子材料的不同器官，分别为根、茎、叶、果实、种子（表1），采集时间为2018年10月10日，采集时期为结果期，均由云南省农业科学院热区生态农业研究所分析测试中心野外采集。

表1 供试野生余甘子材料

1.1.2 仪器和试剂

微波消解仪，意大利Mi lestone Ethos up（maxi-44）；电感耦合等离子体发射光谱仪（ICPOES），德国耶拿PQ-9000；超纯水仪，优普UPHIV-20T；Al、As、B、Ba、Be、Bi、Cd、Co、Cr、Cu、Fe、Ga、Li、Mg、Mn、Ni、Pb、Sb、Sn、Sr、Ti、TI、V、Zn多元素标准溶液（24种，100μg/mL），GSB04-1767-2004，国家有色金属及电子材料分析测试中心；浓硝酸（优级纯），重庆川东化工；过氧化氢（优级纯），天津市化学试剂；试验用水均为超纯水；容量瓶、烧杯等玻璃器皿均用10%硝酸浸泡24 h，均用超纯水清洗，烘干，备用。

1.2 方法

1.2.1 仪器工作条件

试验中微波消解仪的运行程序如表2所示，电感耦合等离子体发射光谱仪的仪器参数设置如表3所示。

表2 微波消解程序

表3 ICP-OES仪器主要参数

1.2.2 样品前处理

将供试样品用流水清洗干净，分成小块，装入纸袋于60℃烘箱中烘干，然后粉碎，备用。用万分之一天平精密称定样品0.200 0 g（干重），置于聚四氟乙烯高压微波消解罐中，加入5mL浓硝酸和3mL过氧化氢，拧紧消解罐，确保完全密封。按照设定好的消解程序加热消解（表2），消解完毕后，冷却至室温，慢慢打开密闭消解罐，以少量2%HNO3洗涤消解罐与盖子2～3次，洗液合并转入50mL的容量瓶中，用2%HNO3定容至刻度，混匀。用50mL注射器吸取样品，然后通过0.45μm的一次性过滤器进行过滤，将滤液转入50mL的离心管中，待上机测试，同时制备空白样品。

1.2.3 标准曲线配制

采用梯度稀释法，用微量移液枪精确吸取100μg/mL的多元素混合标准溶液10mL，定容于100mL容量瓶，制成10μg/mL的标准溶液母液，再从母液中分别吸取标准溶液各0.00、0.50、2.50、5.00、12.50、25.00mL，用2%HNO3进行稀释，定容于50mL容量瓶中，配制成0.00、0.10、0.50、1.00、2.50、5.00mg/L的多元素混合标准溶液，待上机测试。

1.2.4 标准物质的检测

为进一步判断该方法的准确度和可靠性，将上述配制的中等浓度（1.00mg/L）标准溶液当作样品进行重复测定3次，计算该标准物质的相对误差（%）。

相对误差＝［（测定值－标准值）/标准值]×100%。

1.2.5 待测样品的检测

将供试3份余甘子材料不同器官（根、茎、叶、果实、种子）的待测溶液依次进样，分别进行Zn、Cd、Pb、Co、Ni、B、Mn、Fe、Cr、Mg、Cu共11种微量元素质量浓度的测定分析，重复测定3次。

1.2.6 加标回收试验

将余甘子果实样品A待测溶液用移液枪各吸取5.0mL，共6份，精确加入10μg/mL的多元素混合标准溶液各50μL，利用涡旋混合器重复混匀2～3次，然后进行上机测试，重复测定6次，计算样品加标回收率（%）。样品加标回收率公式为：

样品加标回收率＝［（加标后溶质质量－加标前溶质质量）/加标值]×100%。

1.2.7 数据分析

所有数据均采用Microsof t Excel 2003软件进行处理，采用SAS 9.0软件进行多重比较和方差显著性分析。

2 结果与分析

2.1 消解体系的选择

供试样品含有丰富的有机物质，故以浓HNO3添加H2O2的消解体系进行样品的消解。本研究采用微波消解法，对升温时间和温度保持时间进行优化，最终按照表2微波消解程序进行消解，压力上升速度快，样品中有机物能够消解彻底，溶液澄清透明无浑浊，消解效果很好。可能是由于H2O2分解产生的高能态活性氧有利于有机物质的破坏，使得样品能够消解得更为完全。

2.2 检测波长的选择

ICP-OES检测过程中，待测各元素可供选择的检测波长有好几条，本试验根据ICP-OES检测波长互不干扰、谱线强度、背景等效浓度（BEC值）、灵敏度高等原则进行分析谱线的选择，最终确定待测11种元素的检测波长分别为Zn206.200、Cd214.441、Pb220.353、Co228.615、Ni231.604 、B249.773、Mn257.610、Fe259.940、Cr267.716 、Mg279.553和Cu324.754 nm（表4）。

表4 检测波长的选择

2.3 标准曲线和检出限

按照表3中ICP-OES仪器工作条件，测试多元素混合标准溶液，绘制标准曲线并计算出回归方程及相关系数，同时按测试方法进行11次试剂空白，计算出检出限和定量下限，结果见表5。

表5 11种微量元素的线性及检出限

由表5可知，在线性范围内，Zn、Cd、Pb、Co、Ni、B、Mn、Fe、Cr、Mg、Cu共11种元素的线性关系较好，相关系数（r）为0.998 0～0.999 9，检出限为0.000 055～0.081 500 mg/L，定量下限为0.000 2～0.244 6mg/L。

2.4 标准物质的分析

为了验证本方法的准确性和可靠性，本研究把配制的中等浓度（1.00mg/L）的多元素混合标准溶液当作样品进行重复测定3次，计算其相对误差，测试结果见表6。

由表6可知，测定值和标准值基本一致，除了Mg（8.0%）之外，相对误差均较低，在1.0%～4.0%；各元素相对标准偏差（RSD）均低于2.0%，在0.25%～1.58%。结果表明，该方法准确可靠，测试精密度高。

2.5 样品元素含量的测定

按照本方法对供试3份余甘子材料不同器官的11种微量元素含量进行测定分析，测试结果见表7。

表6 标准物质中11种微量元素的测定结果（n＝3）

由表7可知，各元素含量分布存在一定规律，不同材料不同器官中，含量较高的元素均为Zn、Mn、Fe、Mg；含量较低元素为 Cd、Pb、Co、Ni、B、Cr、Cu。进一步对各器官中均检出的Zn、Ni、B、Mn、Fe、Mg、Cu元素进行方差分析（表8）。

由表8可知，Zn、B、Mn、Fe、Mg、Cu各元素在不同器官中的含量存在显著性差异，Ni元素含量各器官间差异不显著。Zn元素含量高低顺序为根＞茎＞叶≈果实≈种子；Ni元素含量为根≈种子≈果实≈叶≈茎；B元素含量为叶＞根≈茎≈果实≈种子；Mn元素含量为根≥叶≥茎≥果实≥种子；Fe元素含量为根＞叶＞果实＞种子≈茎；Mg元素含量为根≥茎≈叶≥果实≈种子；Cu元素含量为果实＞叶≈种子＞根≈茎。说明余甘子不同器官对不同元素的吸收具有一定的选择性，不同器官的各元素之间可能存在相互作用（促进作用或拮抗作用），各元素具体作用及相关机理机制有待进一步深入研究。

2.6 加标回收试验

取样品果实A号各6份，分别吸取5mL，然后精确加入一定量的24种元素混合标准溶液，按本试验仪器工作条件进行测定，以标准曲线计算含量，测试结果见表9。

表7 样品中11种微量元素的测定结果

由表9可知，供试样品中Zn、Cd、Pb、Co、Ni、B、Mn、Fe、Cr、Mg、Cu平均回收率为90.00%～111.65%；相对 标 准 偏 差 （RSD） 为 0.18%～1.37%。结果表明，该方法准确度高、精密度高、可靠性强，适合批量样品多元素同时测定。

表8 余甘子不同器官样品中各元素含量平均值

表9 加标回收试验的测定结果（n=6）

3 讨论与结论

微量元素不仅是人类营养所必需，也是植物生命活动所不可缺少的［23-25]。关于余甘子果实中微量元素的研究已有报道［26]，而对余甘子不同材料不同器官（根、茎、叶、果实、种子）微量元素的差异性研究却鲜见报道。本试验对来源于云南干热河谷特色植物资源3份余甘子材料不同器官中Zn、Cd、Pb、Co、Ni、B、Mn、Fe、Cr、Mg、Cu等11种微量元素进行分析测定，结果表明，余甘子不同材料不同器官中均富含Zn、Mn、Fe、Mg元素，这与蔡英卿等［27]和骆建祥等［28]的研究结果相类似，且含量均高于10mg/kg，含量高低规律为Mg＞Fe＞Zn＞Mn。有研究表明，余甘子中Zn、Mn、Fe、Mg等元素含量与蛋白质、维生素、有机酸、粗纤维、粗灰分和水分等营养成分存在密切相关性［25]。近年来，余甘子根部的植物化学研究是关注的热点，有学者已从余甘子根中分离得到新的三萜类化合物，并进行了抗癌细胞毒性鉴定［29]。余甘子不同器官中Zn、Mn、Fe、Mg等元素含量丰富，这可能与余甘子具有清热解毒、生津止咳、利咽祛痰、抗炎抑菌、抗癌抗肿瘤等药用价值有关。本试验中Cd、Pb等有害重金属均未检出，说明余甘子的野生生长环境未受到污染，可见余甘子不同器官均可以安全地进行有效开发利用。余甘子同一材料不同器官中各元素含量分布差异显著，可能是由于余甘子不同器官的生理功能及生长发育阶段不同，造成余甘子不同器官对元素的吸收和富集的差异，这对指导余甘子不同生育期科学施肥以提高品质产量具有重要意义。此外，同一器官同一元素在不同余甘子材料间也存在较大差异，这可能与材料本身的遗传特性有关，说明云南余甘子种质遗传多样性高，野生资源丰富，可从野生资源中直接选育优良单株或新品种，应该对野生余甘子资源加以保护利用。关于不同来源地余甘子材料中各元素的代谢途径规律、相互作用以及材料间各元素分配差异产生的原因，还有待深入研究。

消解方式及条件的选择，是影响分析测试结果准确性的关键因素［30]。本试验根据文献资料及前期预试验，最终确定5mLHNO3＋3mLH2O2的消解体系，二者比例为5∶3，总体积控制在10mL以内，以保证消解罐中溶液不会过多，避免压力过大而发生爆炸。结果表明，该方法消解能力强，简便高效，一次性可以消解样品多达44个，消解时间仅需1.5 h左右，余甘子根、茎、叶、果实和种子等不同器官均能消解彻底，溶液澄清透明无浑浊，获得了很好的回收率，供试样品中11种元素的加标回收率为90.00%～111.65%，可为其他干热河谷植物样品的前处理提供借鉴。

现有对余甘子微量元素的检测多采用传统分析方法，也未对检测方法的准确性和可靠性作深入研究［27-28]。本研究采用微波消解对余甘子不同器官样品进行前处理，利用ICP-OES测定Zn、Cd、Pb、Co、Ni、B、Mn、Fe、Cr、Mg、Cu等11种微量元素的含量，该方法克服了现有技术中线性范围窄、精密度低、检出限差、样品用量大、分析速度慢、存在化学干扰、不能多元素同时检测等技术缺陷，具备简便高效快捷、结果准确可靠、精度高、重现性好等优势，可用于余甘子及其他干热河谷植物批量样品的多元素同时测定。试验结果表明，余甘子富含多种人体必需的微量元素，而重金属元素含量很低，安全健康无污染，营养价值和药用价值高，是十分重要的药食兼用资源植物。本研究可以为今后余甘子的有效开发和综合利用提供数据参考。