基于HPLC结合化学计量学的银菊合剂指纹图谱研究

张志 吕建伟 覃开羽 吴敏 张蓓 李俊伟 王莹 冯秀芳 卢森华

摘要：采用HLPC法，色谱柱为Agilent Eclipse-C18柱，检测波长为330 nm，流动相为甲醇-0.2%磷酸水溶液梯度洗脱，流速为1.0 mL/min，通过中药色谱指纹图谱相似度评价结合主成分分析对10批次银菊合剂样品进行研究。结果表明，标定出11个共有峰，定性了3个共有峰，指纹图谱相似度均在0.9以上，符合指纹图谱研究技术要求，影响制剂质量差异是多成分协同作用的结果。

关键词：银菊合剂;HPLC;化学计量学;指纹图谱

中图分类号：O69         文献标识码：A

文章编号：0439-8114（2019）16-0110-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.16.025           开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Abstract： Using HLPC， Agilent Eclipse-C18 column， detection wavelength 330 nm， mobile phase was methanol-0.2% phosphoric acid gradient elution， flow rate was 1.0 mL/min. 10 batches of Yinju mixture samples were studied by similarity evaluation of chromatographic fingerprints of traditional Chinese medicine. Results showed that thirteen common peaks were calibrated and three common peaks were qualitatively identified. The similarity of fingerprints was above 0.9， which met the requirements of fingerprint technology. The synergistic effect of multi-components affected the quality of preparations.

Key words： Yinju mixture; HPLC; chemometrics; fingerprint

银菊合剂是柳州市中医医院经验方，通过多年临床观察证明其具良好的清热解毒、疏散风热作用，常用于风热感冒、头痛眩晕、目赤肿痛、疮毒或壮热口渴、小儿胎毒等病症的治疗，且疗效显著。银菊合剂组方含山银花和菊花二味中药，山银花（Lonicera hypoglauca）性甘寒，归肺、心、胃经，具有清热解毒，凉散风热的功效[1]，为君药。现代药理学研究证明，山银花中具有抗菌、抗病毒、解热、抗氧化及保护肝脏的作用[2，3]。山银花的质量控制除了法定标准规定的外观、性状、鉴别及以绿原酸含量为指标进行质量控制外，多集中于不同产地、不同加工方法山银花有效成分的含量测定，并越来越倾向于多种成分的同時测定[4，5];HPLC指纹图谱可用于山银花药材、提取物品质的鉴定[6]。菊花[Dendranthema morifolium（Ramat. ）Tzvel.]性苦、辛、微寒，归肝、心经，散风清热，平肝明目，清热解毒，以增强主药之功效[1]，为臣药。菊花具有抗菌、抗炎、舒血管、抗氧化、抗肿瘤等药理活性[7，8]。二药配伍，苦寒泻火以解毒，甘寒化阴以补虚，标本兼顾，共奏清热解毒、疏散风热之效。中药复方制剂成分复杂，目前采用定量部分指标性成分的方法难以全面控制其质量，中药指纹图谱技术有利于整体获取中药活性组分群，已成为中药真伪优劣鉴别、质量一致性评价和产品稳定性考察的可行模式[9，10]。

目前，指纹图谱结合化学计量学已被广泛地应用于中成药的质量控制[11]，但有关银菊合剂指纹图谱的研究甚少。本研究采用HPLC结合化学计量学对银菊合剂进行指纹图谱研究，为科学评价和有效控制银菊合剂的质量提供参考依据，为下一步形成具有自主知识产权的成果和产业化奠定基础。

1  材料与方法

1.1  试验材料

1.1.1  试剂  银菊合剂样品来源于柳州市中医医院，制备银菊合剂所用饮片购于广西柳州医药股份有限公司、国药控股柳州有限公司和广西柳州百草堂中药饮片厂责任有限公司，经柳州市中医医院药学部中药库唐凤岚副主任中药师鉴定：山银花为忍冬科植物灰毡毛忍冬（Lonicera macranthoides Hand.-Mazz.）、红腺忍冬（Lonicera hypoglauca Miq.）、华南忍冬（Lonicera Confusa DC.）或黄褐毛忍冬（Lonicera fulvotomentosa Hsu et S.C.Cheng）的干燥花蕾或带初开的花;菊花为菊科植物菊（Chrysanthemum morifolium Ramat.）的干燥头状花序，药材形状特征与《中国药典》2015年版描述一致，各饮片产地来源、批号信息见表1。绿原酸（批号110753-201415）、咖啡酸（批号110885-200102）、木犀草苷（批号111720-2013）均由中国食品药品检定研究院提供。乙腈、甲醇（美国Fisher公司，色谱纯），磷酸（天津市光复精细化工研究所，优级纯），高效液相色谱仪用水为超纯水，其他所用试剂均为分析纯。

1.1.2  仪器  1260型高效液相色谱仪（美国Agilent公司）;XS-205Du型电子分析天平（瑞士梅特勒公司）;HH-S6型数显恒温水浴锅（金坛市医疗仪器厂）;Synergy型超纯水机（美国密里博公司）。

1.2  方法

1.2.1  混合对照品溶液的配制  分别精密称定绿原酸、咖啡酸、木犀草苷对照品10 mg，置于25 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，再分别精密量取上述3种对照品准备液1.0 mL，置于同一10 mL量瓶中，用甲醇定容，即得。

1.2.2  供试品溶液的制备  精密量取银菊合剂2.0 mL，置于10 mL量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液即得。

1.2.3  色谱条件  色谱柱为Agilent Eclipse-XDB C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）;流速为1.0 mL/min;检测波长为330 nm;柱温为30 ℃;进样量为5 μL;流动相为甲醇-0.2%磷酸水溶液进行梯度洗脱（乙腈体积分数在0→5 min为10%，5→50 min为10%→90%）。

2  结果与分析

2.1  精密度试验

取S1号银菊合剂2.0 mL制备供试品溶液，按“1.2.3”色谱条件连续进样6次。结果表明，各色谱峰相对保留时间的RSD为0.01%～0.03%，各色谱峰相对峰面积的RSD为0.02%～0.30%，该试验精密度良好。

2.2  重复性试验

取6份S1号银菊合剂供试品溶液，按“1.2.3”色谱条件进行测定，考察样品的重复性。结果表明，6份样品的各色谱峰相对保留时间的RSD为0.04%～0.10%;各色谱峰相对峰面积的RSD为0.4%～3.7%，该方法的重复性良好。

2.3  稳定性试验

取供试品溶液，按“1.2.3”色谱条件，分别于0、2、4、8、12、24 h进样，考察供试品溶液的稳定性。结果表明，各色谱峰相对保留时间的RSD为0.01%～0.08%;各色谱峰相对峰面积的RSD为0.08%～3.60%，说明供试品溶液在24 h内具有良好的稳定性。

2.4  指纹图谱的建立及相似度分析

2.4.1  参照色谱峰的建立  绿原酸为银菊合剂中已知主要成分，而且绿原酸所在指纹图谱中的2号峰保留时间适中，分离度良好，峰面积较大且为共有峰，故选用绿原酸（2号峰）作为参照峰，见图1。

2.4.2  指纹图谱的采集[12]  精密量取10批次的银菊合剂2.0 mL，按“1.2.2”方法制备供试品溶液，并按“1.2.3”色谱条件进行测定，记录10批次银菊合剂的色谱图及数据，建立银菊合剂HPLC指纹图谱（图2），10批银菊合剂HPLC叠加色谱图如图3所示。

2.4.3  共有峰的确定  运用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统A版》计算机软件对指纹图谱数据进行分析评价，10批次图谱都具有的色谱峰标定为共有指纹图谱峰。选择1号银菊合剂的图谱为参照图谱，以平均数法作为生成对照指纹图谱的方法，设定时间窗宽度为0.1 min，软件自动匹配图谱，系统根据银菊合剂的共有模式，生成对照指纹图谱为银菊合剂指纹图谱。以参照峰的保留时间和峰面积作为1，分别计算10批银菊合剂共有指纹峰的相对保留时间和相对峰面积，结果见表2、表3。结果表明，不同批次的银菊合剂共有峰相对保留时间RSD为0.1%～1.0%，相差较小;而相对峰面积RSD相差较大。本试验建立的色谱方法可以使不同批次的银菊合剂具有基本一致的色谱行为，即各批次银菊合剂样品在化学成分种类上基本一致，但不同批次之间各种化学成分的含量受多种因素的影响，因此各峰的峰面积有所差异，各成分的含量有差异。

2.4.4  共有峰的指认  利用对照品对照法对共有峰进行指认，取绿原酸、咖啡酸、木犀草苷对照品，配制成适量浓度，按照“1.2.3”色谱条件进行测定，结果显示3种对照品的保留时间分别与特征色谱图中的2、3、7号峰保留时间一致，并通过在线紫外吸收光谱对照，2、3、7号峰分别与绿原酸、咖啡酸、木犀草苷对照品峰一致，因此可以确定2号峰为绿原酸、3号峰为咖啡酸、7号峰为木犀草苷，这些特征峰可作为控制银菊合剂质量的指标之一。

2.4.5  相似度评价  选择S1号银菊合剂样品的图谱为参照图谱，以平均数法作为生成对照指纹图谱（SR）的方法，时间窗宽度设定为0.1 min，然后进行谱峰识别和谱峰匹配，结果见图3。系统根据银菊合剂样品的共有模式，生成银菊合剂对照指纹图谱并计算相识度，结果见图4和表4。结果表明，10批次银菊合剂样品与对照指纹图谱（SR）的相似度均大于0.9，说明各批次银菊合剂样品图谱与对照指纹图谱有较好的一致性，完全符合HPLC指纹图谱技术要求。

2.4.6  主成分分析  以10批次银菊合剂样品色谱数据的11个共有峰的峰面积为变量，采用SPSS 19.0软件进行主成分分析[13]，以主成分的特征根和贡献率作为选择主成分的依据，提取到2个主成分的特征根大于1的主成分，2个主成分特征值分别为6.690%、2.664%，方差贡献率分别为60.814%、24.220%，且它们的累积方差贡献率大于85.034%，结果见表5。从PCA碎石图（图5）可以看出，先提取出来的2个主成分的坡度较为陡峭，说明所提取的 2个主成分可以代表银菊合剂样品的质量。根据因子荷载矩阵，推测影响银菊合剂样品质量差异的并不是单一成分，而是多成分协同作用的结果。从表6和图6中可以看出，第1主成分的信息主要来自于色谱峰 2、3、5、7、10、11的信息;第2主成分主要来自色谱峰1、4、6、8、9的信息。

3  讨论

中药制剂的生产是一个复杂的过程，生产环节、影响因素多，生产中任何环节出现问题，均对制劑产品的安全有效造成影响。中药自身毒性或潜在毒性、中药之间相互作用、配伍禁忌或者临床用药不合理等因素会引发中药制剂的安全问题。中药制剂的药材来源、处方、制备成型工艺、辅料、储存、运输等涉及中药制剂的质量问题[14]。中药制剂指纹图谱则通过各色谱峰的峰面积或峰高比值来确定样品中化学成分的相对量，并结合数理统计方法通过相似度的比较来评价该制剂质量的优劣，能较为全面地反映中药制剂中所含化学成分的种类与数量，尤其是在现阶段有效成分大部分未明确的情况下，能较全面地反映中药制剂的内在质量[15]。

从10批样品的高效液相色谱指纹图谱中可以看出，不同批次银菊合剂各色谱峰的相对保留时间基本一致，所含成分基本相同，符合指纹图谱的要求。本研究建立银菊合剂指纹图谱，为银菊合剂的质量控制提参考，进而对于其相应制剂的质量控制也会起积极的作用。

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