木枣果实生长过程中细胞壁酶活性变化的研究

陈国梁 任彤 祖欢欢 陈春 张睿 徐露 王旭东 陈宗礼

摘要：以不同生长期木枣（Ziziphus jujube Mill.）果实为材料，测定果实纤维素酶（Cx-cellulase）、β-半乳糖苷酶（β-Gal）、果胶甲酯酶（PME）和多聚半乳糖醛酸酶（PG）等4种细胞壁酶的活性，探究其与木枣果实生长发育的相关性。结果表明，在整个生长过程中，Cx-cellulas酶活性相对平稳上升，β-Gal酶活性从全红期到完熟期迅速达到最大值，PME活性从半红期到全红期迅速下降;PG酶活性在完熟期明显升高;推测Cx-cellulase与木枣果实膨大相关，是木枣软化的重要物质之一;PME在启动木枣果实的转色中起作用;β-Gal和PG则在木枣果实成熟期起关键作用。

关键词：木枣（Ziziphus jujube Mill.）;果实;生长过程;细胞壁酶;酶活性

中图分类号：S665.1         文献标识码：A

文章编号：0439-8114（2019）16-0096-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.16.021           开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Abstract： Using the fruit of different growing period of jujube （Ziziphus jujube Mill.） as materials，the activity of cell wall enzymes of cellulase（Cx-cellulase）， β-galactosidase（β-Gal）， pectin methylesterase（PME）， and polygalacturonase（PG） were observed and discussed the related to the jujube fruit growth processes. The results showed that： in the whole growth， Cx-cellulase was rised stablely， β-Gal reached maximum from full red stage to full ripe stage， PME reduced from half red stage to full red stage， and PG was rised in full ripe stage. It was speculated that Cx-cellulase was related to fruit enlargement of jujube， and it is one of the important substances of softening of jujube fruit. PME may be played a role in starting discolour， β-Gal and PG play a key role in the mature period of jujube fruit.

Key words： jujube（Ziziphus jujube Mill.）; fruit; process of growth; cell wall enzyme; enzyme activity

棗（Ziziphus jujube Mill.）属鼠李科枣属，其鲜果富含人体必需的多种矿物元素[1]，近年来，随着人们对鲜枣营养价值的重新认识及其极好的口味，市场需求增长迅速。但鲜枣采后果肉易腐烂褐变，不耐贮藏，大大缩短了鲜枣的货架期[2，3]。研究表明，大多果实成熟、极度软化等都与细胞壁酶系有关，是一系列酶相互作用的结果[4]。近年来，有关细胞壁酶对果实生长、成熟、衰老等的作用在苹果[5]、树莓[6]、梨[7]等方面的研究均有报道，且主要集中在Cx-cellulase、β-Gal、果胶甲酯酶（Pectin methyl esterase，PME）和多聚半乳糖醛酸酶（Poly galacturonase，PG）等细胞壁酶对果实生长、成熟、衰老等的作用，而有关枣果实的研究鲜见报道。因此，本研究通过测定木枣果实不同生长时期细胞壁酶活性变化，从中找出其与木枣果实生长发育以及成熟软化的相关性，为枣果成熟、衰老的生理生化机理研究提供参考，也可为枣果实生物保鲜、延长货架期提供理论依据。

1  材料与方法

1.1  材料

从陕西省延安市宝塔区张新庄村采摘大小均匀、无病虫害和无机械损伤的木枣果。采取成熟度为幼果期（8月6日）、青果期（8月21日）、泛红期   （9月5日）、半红期（9月20日）、全红期（9月27日）、成熟期（10月4日）、完熟期（10月11日）的果实;清水洗净，当天液氮速冻带回，于-80 ℃冰箱中保存。

1.2  方法

1.2.1  样品的预处理  从冰箱中随机抽取木枣果实10颗，于低温下去核、破碎、研磨，混匀备用。

1.2.2  粗酶液的制备  参考黄志明等[8]的方法，取预处理过的样品1.0 g加入5倍体积pH 5.0的柠檬酸缓冲液，冰浴研磨，15 000 r/min离心20 min，所得上清液即为粗酶液，用于酶活性测定。

1.2.3  酶活性的测定  Cx-cellulase、β-Gal、PME和PG 4种细胞壁酶的活性测定参考文献[8-11]的方法，分别测定OD540 nm、OD400 nm、OD520 nm和OD274 nm。其中Cx-cellulase酶活力以每分钟光密度变化1.0的酶量为1个酶活力单位，其余3种酶活力以每分钟光密度变化0.01的酶量为1个酶活力单位，均以U/g（FW）单位计。所有测定以煮沸5 min的粗酶液为对照，试验均重复3次。

2  结果与分析

2.1  Cx-cellulase酶活性变化

Cx-cellulase酶活性从木枣幼果期至完熟期基本呈平稳上升的趋势（图1），推测Cx-cellulase是木枣果生长发育的主要酶之一。但该酶在泛红期到全红期较其他时期活性上升快（上升27.4%），而该时期正是木枣果实迅速生长膨大期，表明Cx-cellulase可能在其生长中期与果实迅速生长膨大密切相关。

2.2  β-Gal酶活性变化

β-Gal酶活性从木枣幼果期开始持续下降到全红期降至最低，此时酶活性仅为幼果期的28.27%，之后迅速上升，到完熟期达最高，是全红期酶活性的4.6倍（图2）。说明β-Gal与木枣果实的发育初期及迅速生长阶段呈负相关，与成熟期呈正相关，推测该酶在后期成熟阶段发挥重要作用，是木枣果实成熟的关键酶之一。

2.3  PME酶活性变化

木枣PME酶活性从幼果期开始上升至泛红期达到最大值[48.4 U/g（FW）]，该阶段恰好是枣果生长发育时期，从泛红期到全红期迅速下降（71.69%）（图3）。这表明PME与木枣果实的转色启动可能密切相关，在木枣果实生长前期起重要作用，而在其成熟后期作用不大。

2.4  PG酶活性变化

PG酶活性在木枣果实生长过程中有2个明显的变化，青果期是幼果期的1.28倍，完熟期是成熟期的1.30倍，且这2个阶段酶活性变化基本一致（图4）。这表明PG可能与木枣果实的生长相关，而且在成熟阶段发挥重要作用。

3  小结与讨论

不同的细胞壁水解酶在果实成熟软化的不同阶段起不同作用，不同酶类对不同果品影响也不同，其相互作用共同促进并调控果实软化[12]。研究表明，木枣在完熟期时达到成熟[13]，Cx-cellulase在鳄梨、猕猴桃、甜樱桃等果实软化中起重要作用[14]，β-Gal对果实的成熟、软化起一定作用[15]。该试验中，Cx-cellulase、β-Gal和PG活性在木枣果实完熟阶段均呈升高趋势，且达到最大值，可能都与木枣果实成熟软化密切相关。这与温陟良等[16]在赞皇大枣果实中对β-Gal酶活性的研究基本一致，而在测定苹果β-Gal酶活性时发现，β-Gal并不是苹果软化的限制因子[14]。表明不同的果实中β-Gal起不同的作用;PME能够水解果胶分子中甲酯化的C6羧基，改变细胞壁的pH和电位，使果胶结构更易被PG降解，是PG作用的必要前提[17，18]，且PME在木枣软化时期有前导作用[13]。PG参与果胶多糖的降解，膨胀细胞壁，使果实软化[19]。该试验中PME酶活性在泛红期时最大，此时PG酶活性正在上升，当PME活性基本稳定时，PG酶活性达到高峰，且其活性高峰远远晚于PME，PG在木枣果实成熟后期扮演重要角色。综上所述，认为4种细胞壁酶在木枣果实生长成熟过程中均有作用，但对于其成熟软化的机理，还需要更深入的研究。

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