气管瘢痕狭窄动物模型的建立和病理学研究

汤苏成 王跃建 朱肇峰*

（佛山市第一人民咽喉头颈外科，广东 佛山 528000）

长期以来，气管瘢痕性狭窄是耳鼻咽喉－头颈外科工作常遇到的一大难题。要在气管瘢痕狭窄的治疗上取得突破，就必须了解气管瘢痕的发生机制及影响因素。由于缺少稳定的动物模型，很多对瘢痕的研究成果均来源于皮肤瘢痕[1-2]。我们拟建立了犬气管狭窄的动物模型，研究气管瘢痕狭窄的形成过程和病理学特点，为下一步的研究奠定基础。

1 资料与方法

1.1 材料与设备：成年比格犬6只，购自广东省实验动物中心。体质量在30～40 kg。实验及动物饲养场所由广东省医学实验动物中心提供。HE染色试剂由佛山市第一人民医院病理科提供。纤维连接蛋白（Fn）兔抗人多克隆抗体、MaxvisionTM免疫组化试剂盒，购至福州迈新生物科技有限公司。苦味酸－天狼猩红溶液，购至北京海德生物有限公司。CM10型透射电镜：由中山大学电子显微镜室提供使用。E600POL偏光显微镜：由中科院广州地球化学研究所提供使用。

1.2 动物模型：实验动物盐酸氯胺酮200mg肌肉注射诱导麻醉后，从前肢静脉持续静滴0.1%氯胺酮葡萄糖盐溶液维持麻醉。在气管下段行气管切开并永久皮肤造瘘。取颈前纵切口，暴露气管。切开气管前壁正中，切口长3 cm。拉开气管前壁小心刮除此段气管前1/2内壁黏膜到软骨膜，3-0可吸收线缝合气管前壁，再逐层关闭术腔。分别术后1周、2周、1个月、2个月、4个月、6个月行支气管镜检查；同时取瘢痕处病例标本进行病理学检查。6个月时处死动物取全层气管标本进行观察。

表1 CD3 T淋巴细胞、CD68巨噬细胞计数的半定量分析（个/4.48×104μm2）

表2 纤维连接蛋白和Ⅰ＋Ⅲ型胶原含量的半定量分析（目标面积×104 μm2/2.24×104μm2）

1.3 大体标本及常规HE染色。

1.4 免疫组化（MaxvisionTM法）：行CD3T淋巴细胞，CD68巨噬细胞和纤维连接蛋白（Fn）免疫组化染色。

1.5 胶原纤维的分析：行Ⅰ、Ⅲ型胶原苦味酸－天狼猩红染色。暗视野条件下用偏振光显微镜下观察。显微镜下观察。每张切片随机于固有层取4幅视野，于400倍镜下采用全自动图像分析对T细胞，巨噬细胞数半定量分析，统计场总面积分别为4.48×104μm2。于200倍显微镜下分析纤维连接蛋白（Fn）和I、III型胶原纤维的目标面积。统计场总面积为2.24×104μm2。

1.6 透射电镜观察：每个观察点均取1 mm×1 mm×3 mm新鲜气管瘢痕组织经超薄切片后，透射电镜（CM10型）下观察。

2 结 果

2.1 术后情况：实验动物术后一般情况好，所有实验动物全部存活到预定时间。大体及HE染色观察，术后1周可见肉芽组织开始增生突向管腔；在术后2个月时肉芽组织增生达到高峰，管腔进一步狭窄狭窄，术后4个月及6个月气管瘢痕基本稳定，气管中重度挛缩，有瘢痕样色素沉着。镜下气管创面为复层鳞状上皮细胞，固有层肥厚紊乱，仍可见成纤维细胞。

2.2 慢性炎性细胞：术后1周开始固有层中可见大量T细胞、巨噬细胞浸润，分布广、密度高。细胞体积大，时间持续至术后4个月，之后开始较少。见表1。

2.3 细胞外基质：纤维连接蛋白（Fn）免疫组化显示成纤维胞胞质、胞膜可见大量网格分布的阳性信号。持续存在至术后6个月。偏振光显微镜下，固有层中波纹状长、红色的Ⅰ型胶原明显增多，排列紊乱，呈漩涡状、团块状。黄绿色、细纤维的Ⅲ型胶原量少，排列紊乱。见表2。

2.4 透射电镜：术后1个月开始气管黏膜开始为鳞状上皮覆盖，至4个月时完全覆盖。固有层中可见大量粗的，厚度不同、方向混乱的胶原纤维，胶原丝中胞质内丝和粗面内质网槽的胞质明星突起。术后1～6个月均可见成纤维细胞，胞质内粗面内质网丰富，游离核糖体丰富，核大、核仁亦大，常染色质丰富。

3 讨 论

随着兔耳瘢痕模型的建立，皮肤瘢痕的研究进入了一个新的阶段，瘢痕形成的机制也研究到细胞分子、基因调控水平[3]。而由于缺少稳定的实验模型，对气管瘢痕的研究更是还处于起步阶段，因此，我们希望能建立稳定的气管瘢痕狭窄的动物模型，研究气管瘢痕的特点和形成过程，并为下一阶段的研究奠定基础。本实验刮除犬气管前1/2的黏膜，创面裸露后，术后大体及病理观察明确瘢痕形成。我们认为，是一种可行的气管瘢痕狭窄模型建立方法。

我们的病理学观察发现，气管瘢痕与慢性炎性细胞浸润、细胞外基质成分改变及排列紊乱、成纤维细胞持续功能亢进关系密切。

我们发现，本实验中，从术后1周开始，CD3T淋巴细胞、CD68巨噬细胞异常增高并持续浸润。局部炎性细胞可通过释放细胞因子，激活巨噬细胞释放介质，从而诱导成纤维细胞的增生和胶原的合成，导致胶原的大量沉积和无序排列[4]。

Fn是一组与创伤修复关系最密切的结构性糖蛋白，是细胞外基质重要成分。如果Fn持续高水平表达，可致使成纤维细胞和内皮细胞的凋亡速度减慢或中断，成纤维细胞相对过剩，导致增生性瘢痕形成[5-6]。我们发现，气管瘢痕组织中，纤维连接蛋白（Fn）在黏膜固有层持续高表达至术后6月，因此，我们推断，Fn在气管瘢痕形成中同样发挥的巨大作用。

成纤维细胞在皮肤瘢痕形成中有着关键性的作用。成纤维细胞是合成细胞外基质主要细胞，具有很强的分泌胶原的能力，还能分泌一系列的细胞因子介导瘢痕的形成[7-8]。正常创伤愈合后期，成纤维细胞凋亡，最终消失，瘢痕亦停止生长。如果成纤维细胞不能进入凋亡途径，就会导致增生性瘢痕的产生[9-10]。本研究发现，气管瘢痕形成过程中，成纤维细胞明显增多，电镜下细胞处于高分化状态，同样具有关键作用。本实验成功建立了气管瘢痕狭窄的动物模型，并对瘢痕形成的机制进行了初步探讨。我们发现，气管瘢痕形成与上皮细胞缺损、慢性炎性细胞浸润、细胞外基质紊乱和成纤维细胞生物活性关系密切，这为我们下一步的更深层机制和治疗策略的研究提供了方向。