艾塞那肽对同型半胱氨酸诱导人脐静脉内皮细胞损伤的影响

邓国雄 韦金儒 陈梅香

[摘要]目的 探討艾塞那肽对同型半胱氨酸（Hcy）诱导人脐静脉内皮细胞（HUVECs）损伤的影响。方法 采用Hcy诱导HUVECs建立炎症损伤模型，分为对照组（正常培养）、模型组（200 μmol/L Hcy）、艾塞那肽低剂量组（200 μmol/L Hcy，EXE-L 5 nmol/L）、艾塞那肽中剂量组（200 μmol/L Hcy，EXE-M 10 nmol/L）、艾塞那肽高剂量组（200 μmol/L Hcy，EXE-H 20 nmol/L）。检测各组的细胞生存活性，比较各组的一氧化氮（NO）含量、白介素-6（IL-6）水平、细胞间黏附因子-1（ICAM-1）水平、内皮素-1（ET-1）水平、抑制蛋白κB-α（IκBα）和核转录因子-κB（NF-κB） p65蛋白表达。结果 模型组的细胞生存活性、NO含量、IκBα蛋白表达均明显低于对照组，IL-6、ICAM-1和ET-1水平及NF-κB p65蛋白表达均明显高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）;艾塞那肽各组的细胞生存活性、NO含量、IκBα蛋白表达均明显高于模型组，IL-6、ICAM-1和ET-1水平及NF-κB p65蛋白表达均低于模型组，差异有统计学意义（P<0.05）。结论 艾塞那肽通过抑制炎症反应改善Hcy诱导的HUVECs损伤。

[关键词]艾塞那肽;人脐静脉内皮细胞;同型半胱氨酸;一氧化氮

[中图分类号] R33          [文献标识码] A          [文章编号] 1674-4721（2019）6（a）-0004-04

[Abstract] Objective To explore the influence of Exenatide on homocysteine （Hcy） -induced injury in human umbilical vein endothelial cells （HUVECs）. Methods Hcy-induced HUVECs were used to establish an inflammatory injury model， which were divided into the normal group， the model group （200 μmol/L Hcy）， the low dose of Exenatide treatment group （200 μmol/L Hcy， ExE-L 5 nmol/L）， the medium dose of Exenatide treatment group （200 μmol/L Hcy， ExE-M 10 nmol/L）， the high dose of Exenatide treatment group （200 μmol/L Hcy， ExE-H 20 nmol/L）. The cell viability in each group was detected， and the content of nitric oxide （NO）， the level of interleukin-6 （IL-6）， the level of intercellular adhesion factor-1 （ICAM-1）， the level of endothelin-1 （ET-1）， the expression of inhibitor protein kappa B-alpha （IκBα） and nuclear factor-κB （NF-κB） p65 protein were compared. Results The cell viability， the content of NO and protein expression of IκBα in the model group were significantly lower than that in the control group， the supernatant levels of IL-6， ICAM-1 and ET-1 and protein expression of NF-κB p65 in the model group were significantly higher than those in the control group， with significant difference （P<0.05）. The cell viability， the content of NO and protein expression of IκBα in the each Exenatide group were significantly lower than those in the model group， the supernatant levels of IL-6， ICAM-1， ET-1 and the protein expression of NF-κB p65 in the each Exenatide group were significantly lower than those in the model group， with significant difference （P<0.05）. Conclusion Exenatide can improve Hcy-induced HUVECs， injuried through inhibiting inflammatory response.

[Key words] Exenatide; Human umbilical vein endothelial cells; Homosyteine; Nitric oxide

高同型半胱氨酸（hyperhomocysteinemia，HHcy）与心脑血管疾病的发病密切相关[1]。近年来的流行病学调查研究证实我国人群中HHcy总体患病率达27.5%，此类人群将面临较高的心脑血管疾病风险[2]。糖尿病患者血浆中的HHcy浓度较正常人增高，高血糖合并HHcy更易诱发动脉内皮功能障碍，增加心血管疾病的发生[3-4]。艾塞那肽是胰高血糖素样肽1受体激动剂（glucagon like peptide 1 receptor agonist，GLP-1 RAs），临床上主要用于2型糖尿病的治疗。艾塞那肽除具有降糖、减轻体重、改善胰岛素抵抗等作用外，还具有保护血管内皮功能作用，具体作用机制尚未完全明确[5-6]。目前，国内外已有不少关于艾塞那肽对Hcy氧化损伤人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）的作用研究，但有关炎症反应的影响未见报道。本研究拟通过体外以Hcy诱导HUVECs炎症损伤再予以艾塞那肽干预，探讨其影响及可能机制。

1材料与方法

1.1试剂与耗材

HUVECs（上海中乔新舟生物公司），艾塞那肽和HHcy（Sigma，美國），CCK-8试剂盒（日本同仁化学研究所）;一氧化氮试剂盒（南京建成生物工程研究所），内皮素（ET）-1、白介素6（IL-6）和细胞间黏附分子-1（ICAM-1）ELISA试剂（武汉华美生物工程有限公司），核转录因子-κB（NF-κB）p65抗体和抑制蛋白κB-α（IκBα）抗体（Abcam，美国）。

1.2细胞培养与分组

HUVECs用含10%胎牛血清的DMEM培养液培养，置于37℃、含5% CO2的培养箱，每2天换液1次，当镜下细胞密度达80%左右以适量胰酶消化、完全培养基适时终止，离心后按1∶2传代。为排除血清干扰及各组细胞同步化，干预前各组换DMEM无血清培养液过夜。细胞分5组（各组设置3个复孔），具体如下。①对照组：加DMEM无血清培养基;②模型组：加含200 μmmol/L Hcy的DMEM无血清培养基;③低剂量EXE组（EXE-L组）：加含5 nmol/L EXE的无血清DMEM培养基预孵育2 h后加Hcy 200 μmol/L;④中剂量EXE组（EXE-M组）：含10 nmol/L EXE的无血清DMEM培养基预孵育2 h后，加200 μmol/L Hcy共培养;⑤高剂量EXE组（EXE-H组）：含20 nmol/L EXE的无血清DMEM培养基预孵育2 h后，加Hcy 200 μmol/L共培养。以上五组处理后置入细胞培养箱共培养48 h。

1.3 HUVECs生存活性检测

取对数生长期的HUVECs按1×104/孔接种于96孔板中，分组处理同前述“1.2”，把各孔原培养基吸弃后分别加入100 μl含CCK-8试剂的无血清DMEM培养基，继续在细胞培养箱孵育1 h，以酶标仪450 nm波长测定各组OD值。根据各组OD值与对照组比较作统计分析。

1.4 IL-6、ICAM-1和ET-1含量的测定

取对数生长期的HUVECs接种于96孔板中，分组处理同前述“1.2”，收集各组细胞上清液，转移于无菌EP（1.5 ml）中，上清液按3000 r/min（半径r=8.4 cm）离心3 min后。用夹心法ELISA检测细胞各组上清液的IL-6、ICAM-1和ET-1含量（操作步骤按试剂盒说明进行）。

1.5一氧化氮（NO）含量的测定

HUVECs种植于6孔板培养皿中，分组处理同前述“1.2”，吸取各组上清液，离心机5000 r/min（r=8.4 cm）离心，5 min后收集上清液作待测样本，使用硝酸还原法进行测定（具体操作按试剂盒说明）。

1.6蛋白免疫印迹试验检测ⅠκBα和NF-κB p65蛋白的表达

HUVECs接种于6孔板细胞培养皿中，分组处理同前述“1.2”。收集各组细胞加裂解液，低温裂解后离心取上清、蛋白定量，各组取等量样品上样，依次进行聚丙烯酰胺凝胶电泳、切胶、转膜，BSA液封闭后适当洗膜，4℃低温一抗孵育过夜后，TBST液充分洗膜，二抗孵育1 h，充分洗膜后暗室内显影，以β-actin作内参，取各组目的蛋白灰度值与内参灰度值的比值作统计学分析。

1.7统计学方法

采用SPSS 20.0统计学软件进行数据处理，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，两独立样本均数的比较采用t检验，多组样本均数间的比较采用单因素方差，方差齐使用LSD-t检验，方差不齐改用Dunnett′s T3法检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1不同处理对HUVECs生存活性和NO含量的影响

模型组的细胞生存活性和NO含量显著低于对照组，差异有统计学意义（P<0.01）;EXE-L组、EXE-M组和EXE-H组的细胞生存活性和NO含量显著高于模型组（P<0.05或P<0.01）（表1）。

2.2不同处理对HUVECs分泌IL-6、ICAM-1和ET-1水平的影响

模型组的IL-6、ICAM-1和ET-1水平均显著高于对照组，差异有统计学意义（P<0.01）;EXE-L组、EXE-M组和EXE-H组的IL-6、ICAM-1和ET-1水平显著低于模型组，差异有统计学意义（P<0.05或P<0.01）（表2）。

2.3不同处理对HUVECs表达IκBα和NF-κB p65蛋白的影响

模型组的IκBα蛋白表达显著低于对照组，EXE-L组、EXE-M组和EXE-H组的IκBα蛋白表达显著高于模型组，差异有统计学意义（P<0.05，P<0.01或P<0.001）;模型组的NF-κB p65蛋白表达显著高于对照组，EXE-L组、EXE-M组和EXE-H组的IκBα蛋白较模型组显著减少，差异有统计学意义（P<0.01或P<0.001）（图1～2）。