渭南地区鸡大肠杆菌的分离鉴定与耐药性检测

李娟娟，魏 恒

(渭南职业技术学院，陕西 渭南 714026)

鸡大肠杆菌病是由大肠埃希氏菌的致病性血清型引起鸡的一种传染病，常见致病血清型主要为O78:K80、O2:K1、O1:K1，其次是O55、O35等[1]。临床上表现有急性败血型、输卵管炎、肠炎、气囊炎、卵黄性腹膜炎等多种病型，其中以急性败血型危害最大，其病变主要为心包炎、肝周炎和腹膜炎等。本病多发生于雏鸡和青年鸡，主要通过消化道、呼吸道传播，全年均可发生，但以冬末春初较为多见。近年来，随着养鸡业的迅速发展，该病已成为困扰养鸡场的重要疾病之一。由于该菌有许多血清型，鸡只发病时常与其他疾病并发或继发，又因在养鸡生产中盲目滥用抗菌药物，致使其耐药菌株逐步增多，造成该病的临床治疗难度增加，给养鸡业带来了巨大损失。笔者研究主要从渭南地区养鸡场中采集疑似鸡大肠杆菌病病料样品，对病料样品进行细菌的分离鉴定、致病性试验和耐药性试验，以掌握本地区鸡大肠杆菌的耐药现状，为临床防治该病提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料来源 从渭南地区养鸡场疑似鸡大肠杆菌病病死鸡中，无菌采集肝脏、脾脏和心脏病料样品共计33份。

1.1.2 试剂 营养肉汤培养基、普通琼脂培养基、伊红美蓝培养基、麦康凯培养基和MH琼脂培养基，细菌微量生化反应管，细菌药敏纸片等均购于杭州滨和微生物试剂有限公司。

1.1.3 供试动物 1日龄健康海兰褐蛋雏公鸡，购于蒲城县龙池种鸡场。试验期间隔离饲养，统一管理。

1.2 方法

1.2.1 病原菌分离纯化 将采集的病料样品在无菌条件下，接种于麦康凯培养基，37℃培养24 h。然后挑取疑似菌落再接种于伊红美蓝培养基，37℃培养24 h，选取疑似菌落进行革兰氏染色，油镜观察细菌形态。将符合大肠杆菌形态特征的疑似菌落接种于普通琼脂培养基进行纯化培养，冷藏备用。

1.2.2 生化试验 根据细菌微量生化反应管产品使用说明，将纯化后的待检菌进行麦芽糖、乳糖、甘露醇和葡萄糖发酵试验，靛基质试验、MR试验、尿素酶试验、V-P试验、明胶液化试验和枸橼酸盐利用试验，观察并记录试验结果。

1.2.3 致病性试验 分别将生化试验鉴定后的菌株接种于营养肉汤，37℃培养24 h。将3日龄雏鸡随机分组，每组10只，试验组每只雏鸡腹腔注射0.2 mL营养肉汤培养物，对照组每只雏鸡腹腔注射0.2 mL无菌营养肉汤。对照组和试验组分别隔离饲养7 d，期间观察雏鸡发病和死亡情况，并对死亡雏鸡及时剖检，采集肝脏、脾脏和心脏病料。7 d后对试验组仍存活的雏鸡进行剖检，观察剖检病变，并采集病料。随后对采集病料进行分离纯化和生化试验。

1.2.4 药敏试验 采用纸片琼脂扩散法(K-B法)，选取15种常用抗菌药物进行鸡大肠杆菌的耐药性检测。将致病性菌株分别接种于营养肉汤，37℃培养24 h。然后取营养肉汤培养菌液适量，均匀涂抹于MH琼脂培养基，约5 min待干后，分别将药敏纸片均匀粘贴于MH琼脂培养基上，并使其严密附着。37℃条件下将平板倒置培养16～18 h，观察并判定结果。

2 结果与分析

2.1 分离纯化结果

从渭南地区养鸡场采集的病料中共分离出疑似大肠杆菌菌落27株，分离菌落在在麦康凯培养基上呈红色，表面光滑、湿润、边缘波状或整齐、微凸起；在伊红美蓝培养基上为紫黑色，圆形，带金属光泽。用革兰氏染色为阴性菌，油镜观察为杆菌，两端钝圆，散在或成对排列。其菌落特征、革兰氏染色和镜检结果与大肠杆菌相吻合。

2.2 生化试验结果

27株疑似大肠杆菌分离菌株均能利用甘露醇、乳糖、麦芽糖和葡萄糖，产酸产气，枸橼酸盐利用试验、明胶液化试验、V-P试验和尿素酶试验结果均为阴性，MR试验和靛基质试验为阳性，试验结果符合大肠杆菌生化特性，说明分离菌为大肠杆菌。

2.3 致病性试验结果

27组试验组中有26组在接种大肠杆菌4 h后开始发病，雏鸡出现精神沉郁、食欲下降、厌动、翅下垂、下痢等症状，8 h后开始出现死亡，18～24 h为死亡高峰期；1个试验组和对照组鸡只正常，无死亡。将26组试验组的病死鸡和7 d后未死亡的鸡进行剖检，均出现不同程度的心包炎、肝周炎、气囊炎和肠炎，具体表现为心包积液，心包膜增厚、增厚，肝脏肿大，严重的附着有纤维性渗出物；肠管黏膜充血或出血。1组试验组和对照组鸡只剖检没有病变。采集病料进行分离鉴定，结果与大肠杆菌特性相同。结果表明经生化试验鉴定的27株分离菌株中有26株为致病性大肠杆菌。

2.4 药敏试验结果

由表1可知，将分离鉴定的26株致病性大肠杆菌分别进行15种常见抗菌药物的耐药性检测，结果表明，对头孢曲松和阿米卡星敏感的菌株较多，分别占分离菌株的76.9%和65.4%；对阿莫西林、复方新诺明、四环素、链霉素、多粘菌素和恩诺沙星等药物耐药的菌株较多，均达53%以上，其中对阿莫西林、四环素和复方新诺明耐药菌株最多，分别达84.6%、76.9%和73.1%。

表1 分离菌株药敏试验结果

3 讨论

近年来，由于养鸡场对抗菌药物的不合理使用，造成鸡大肠杆菌的耐药性不断增强，其主要原因就是大肠杆菌的耐药性随着耐药质粒的转移而产生[2]。笔者试验对分离鉴定的26株致病性大肠杆菌分别进行15种常见抗菌药物的耐药性检测，结果表明，分离菌株对头孢曲松和阿米卡星较为敏感，对阿莫西林、复方新诺明、四环素、链霉素、多粘菌素和恩诺沙星等药物的耐药性较强。对分离菌株进行耐药性分析得出，渭南地区鸡大肠杆菌对多种抗菌药物产生了耐药作用，且具有多重耐药性，耐药菌谱广的特点，这可能与本地区养鸡场临床上长期不规范使用或滥用抗菌药物有关。

与其他地区鸡大肠杆菌的耐药性相比，张强等对安丘市部分鸡场分离鉴定的16株致病性鸡大肠杆菌进行药敏试验，结果发现分离的鸡源大肠杆菌对头孢曲松敏感，对阿米卡星、头孢噻肟、氨曲南和头孢他啶较为敏感[3]。林大捷对海南文昌某种鸡场疑似鸡大肠杆菌病的病料进行分离鉴定与药敏试验研究，结果表明分离菌株对头孢哌酮、多粘菌素B、头孢拉定、庆大霉素、新霉素、阿米卡星等药物敏感[4]。谭菊等对江苏省大丰地区分离鉴定的186株鸡大肠杆菌菌株进行药敏试验，结果发现分离菌株对硫酸粘菌素、头孢噻呋、头孢噻肟、卡那霉素、氧氟沙星和新霉素高度敏感[5]。韦丽莉对廊坊地区分离的205株大肠杆菌开展药敏试验，结果表明分离株对头孢喹肟钠、安普霉素、大观霉素、美罗沙星等抗菌药物敏感[6]。魏清宇对山西省北部地区分离鉴定的134株大肠杆菌进行药物敏感性试验，结果表明分离菌株对卡那霉素和头孢喹肟较敏感[7]。由此说明，不同地区引起鸡大肠杆菌病的致病菌耐药性也有所不同，这与当地常用抗菌药物的不同有很大关系。

总之，由于大肠杆菌的血清型众多，且没有交叉保护性，易产生耐药性，不同地区鸡场该菌的耐药性也有很大差别，临床上还常与其他疾病并发或继发，给本病的防控造成很大困难。因此，本病的防控应注意做好环境卫生，加强鸡只饲养管理，消除疾病发生诱因，控制饲养密度，定期消毒，卫生防疫措施要严格执行；对发病严重地区可制备针对本场的自家灭火苗；临床治疗时要先分离出病原菌，再进行耐药性检测，以挑选敏感性药物进行治疗。