芭蕉根促成骨细胞增殖及分化的有效组分筛选研究

董莉 许敏 陈华娟 郭婷 董永喜

[摘要] 目的 对芭蕉根提取物各组分促成骨细胞增殖及分化的有效组分进行筛选。方法 于2018年6月—2019年1月，采用人成骨肉瘤SaOS-2细胞，芭蕉根各组分组加入浓度为100 mg/L作用细胞48 h 后，用噻唑蓝（MTT）法检测细胞增殖，酶联免疫法（ELISA）法检测细胞上清液中碱性磷酸酶（ALP）、钙离子（Ca2+）和骨钙素（BGP）的含量。 结果 与空白对照组比较，药物B、C、D组分均可显著促进细胞的增殖（P<0.05），分别使细胞增殖16.74%、5.57%、10.02%;升高细胞中 ALP的含量（P<0.005），分别使细胞中 ALP的含量增加58.11%、21.45%、39.57%;促进细胞中Ca2+、BGP 的分泌（P<0.01），其中B组分的作用最显著。 结论 B组分为芭蕉根促成骨细胞增殖及分化的有效组分，其可能通过升高ALP、Ca2+的含量、促进BGP的分泌从而促成骨细胞增殖及分化。

[关键词] 芭蕉根;有效组分;成骨细胞; 增殖及分化

[中图分类号] R285          [文献标识码] A          [文章编号] 1674-0742（2019）06（c）-0013-04

[Abstract] Objective To screen the effective components of the growth and differentiation of bone cells in the extracts of banana root. Methods From June 2018 to January 2019， human osteosarcoma SaOS-2 cells were used. The cells of the banana roots were added to the cells treated with 100 mg/L for 48 h， and then detected by MTT assay. Cell proliferation and enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA） were used to detect the contents of alkaline phosphatase （ALP）， calcium （Ca2+） and osteocalcin （BGP） in the supernatant. Results Compared with the blank control group， the B， C， and D components significantly promoted cell proliferation （P<0.05）， and the cells proliferated 16.74%， 5.57%， and 10.02%， respectively. The content of ALP （P<0.005） increased the content of ALP in cells by 58.11%， 21.45% and 39.57%， respectively， and promoted the secretion of Ca2+ and BGP in cells （P<0.01）. Most notable in group B. Conclusion Group B of component is an effective component of banana root promoting osteoblast proliferation and differentiation. It may promote osteoblast proliferation and differentiation by increasing the content of ALP and Ca2+ and promoting the secretion of BGP.

[Key words] Banana root; Effective components; Osteoblasts; Proliferation and differentiation

芭蕉根，为芭蕉科植物芭蕉Musa basjoo Sied.et Zucc.的干燥根茎，收载于《贵州省中药材、民族药质量标准》2003 年版[1-2]。具有清热解毒，止渴利尿之功效。用于风热头痛，水肿脚气，血淋，肌肤肿痛，丹毒。已收入国家药品标准的以芭蕉根为原料开发的制剂品种骨康胶囊、肿痛舒喷雾剂具有滋补肝肾，强筋壮骨，通络止痛之功效的功效，用于治疗骨质疏松、骨折、跌打损伤、瘀血腫痛等症时疗效显著。有关芭蕉根促成骨细胞增殖的研究目前未见报道，因此该实验于2018年6月—2019年1月选择人成骨肉瘤细胞株SaOS-2， 观察芭蕉根提取物的各个组分对成骨细胞增殖及分化的影响，筛选芭蕉根促成骨细胞增殖及分化的有效组分，探讨其可能的作用机制，皆在为临床应用提供参考，现报道如下。

1  资料与方法

1.1  一般资料

人成骨肉瘤细胞SaOS-2，购自中科院上海细胞库。芭蕉根药材经贵州医科大学中药标本馆龙庆德教授鉴定鉴定为芭蕉Musa basjoo Sied.et Zucc.的干燥根茎。

1.2  主要试剂

McCOYs 5A 培养基（批号2018-16）;胎牛血清（批号：NZE3158）;噻唑蓝（批号：M8345）;维生素D3注射液（批号：20180361）;碱性磷酸酶试剂盒（批号20180120）;钙离子试剂盒（批号A038-4）;骨钙素试剂盒（批号G053-9）。

1.3  方法

1.3.1  芭蕉根组分的制备  芭蕉根500 g，分别加10倍、8倍、8倍70%乙醇回流提取3次，每次2 h，过滤，合并滤液，回收乙醇并浓缩至浸膏。浸膏加蒸馏水制成混悬液，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，得到各个萃取液，剩余的水部分回收溶剂，挥干，干燥分别得A、B、C、D组分。

1.3.2  细胞增殖检测  取对数生长期的SaOS-2细胞 以1×104个/孔将接种于96孔板中，置37 ℃、5%CO2培养箱中孵育24 h后。空白对照组加不含药培养基，药物组每孔加入浓度为100 mg/L的各组分100 μL，阳性对照组为含30 mg/L维生素D3的培养液。继续培养48 h后，采用噻唑蓝在酶标仪在490 nm波长处检测各组吸光度值。

1.3.3  ALP含量检测  取对数生长期的SaOS-2细胞 以1×105个/孔将接种于24孔板中，置37 ℃、5%CO2培养箱中孵育24 h后。空白對照组加不含药培养基，药物组每孔加入浓度为100 mg/L的各组分100 μL，阳性对照组为含30 mg/L维生素D3的培养液。继续培养48 h后，按试剂盒说明书测定ALP的含量。

1.3.4  Ca2+、BGP含量检测  取对数生长期的SaOS-2细胞 以1×105个/孔将接种于24孔板中，置37℃、5%CO2培养箱中孵育24 h后。空白对照组加不含药培养基，药物组每孔加入浓度为100 mg/L的各组分100 μL，阳性对照组为含30 mg/L维生素D3的培养液。继续培养48 h后，按试剂盒说明书测定Ca2+、BGP的含量。

1.4  统计方法

数据采用 SPSS 17.0统计学软件分析，计量资料以（x±s）表示， 组间采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2  结果

2.1  对细胞增殖的影响

结果显示，与空白对照组比较，药物B、C、D组分均可显著促进细胞的增殖（P<0.05），分别使细胞增殖16.74%、5.57%、10.02%。见表1。

2.2  对ALP含量的影响

结果显示，与空白对照组比较，药物B、C、D组分均能显著升高细胞中 ALP的含量，差异有统计学意义（P<0.005），分别增加58.11%、21.45%、39.57%，其中B组分使细胞中 AL含量升高至（1479.48±45.87）U/g，见表2。

2.3  对Ca2+、BGP含量的影响

结果显示，与空白对照组比较，药物B、C、D组分均能显著促进细胞内Ca2+的分泌、升高细胞中BGP 的含量（P<0.01），其中B组分使细胞中Ca2+、BGP的含量分别升高至（179.61±16.83）μg/L和（19.15±3.07）μg/L，见表3。

3  讨论

芭蕉根作为民间常用药材，用于治疗骨质疏松、骨折等疾病，在临床上发挥了较好的治疗作用。芭蕉根含有蒽醌、皂苷、香豆素、多糖、黄酮、挥发油等化学成分[3-7]，具有抗菌、抗炎镇痛、降血糖及α -葡萄糖苷酶抑制等多种药理活性[8-10]，到目前为止，芭蕉根促成骨细胞增殖的研究基本上属于空白。由于物质基础的不明确使得临床上所有含有芭蕉根的药物多为复方。缺乏芭蕉根有效组分/成分的研究，就缺乏对症用药的客观、科学的依据，难以保证芭蕉根相关药品的临床药效，严重制约了芭蕉根在防治骨科方面疾病作用的充分发挥以及相关产品的深度开发。

骨质疏松症是一种以低骨量和骨组织微结构为特征，导致骨质脆性增加和骨量流失的全身性骨代谢疾病。骨质疏松多见于老年人及绝经后的妇女，是现今社会面临的医疗问题之一。目前的治疗药物主要有降钙素、雌激素、罗钙全、钙制剂等。但大多存在着食欲减退、敏、恶心、头昏等不良反应，且一旦停药，会导致骨质流失速度加快。中草药抗骨质疏松具有独特的优势，既有强筋壮骨的、消肿止痛作用，又具备免疫调节效应，具有远期疗效好、副作用小等优点。因此，从中草药中研究发现抗骨质疏松的药效物质，对抗骨质疏松新药的研发具有重要的现实意义和科学价值。

ALP是成骨细胞分泌的一种外酶，可以破坏钙化抑制剂，使得钙和磷可与胶原分子的胶原氨基酸残基相结合，从而加强成骨细胞的钙化功能，因此它的表达是成骨细胞增殖分化的一个明显特征[11-15]。因此，该实验考察了芭蕉根不同组分对SaOS-2细胞中ALP含量的影响。结果显示， 与空白对照组比较，药物B、C、D组分均可显著升高细胞中 ALP的含量（P <0.005），分别使细胞中 ALP的含量增加58.11%、21.45%、39.57%。Ca2+是细胞内第二信使，在成骨细胞中发挥了至关重要的作用，成骨细胞的活性与成骨细胞内钙Ca2+浓度呈正相关，即Ca2+浓度的上升直接促进成骨细胞的增殖、分化[16-17]。BGP是成骨细胞分化时所分泌的一种非胶原蛋白质， 是成骨细胞的特异性产物，为人体骨骼所释放的一种激素， 由49个氨基酸构成， 具有维持骨的正常矿化速率的作用，主要反映成骨细胞功能水平，特别是新形成的成骨细胞的活动状态[18-19]。因此，检测药物对Ca2+及BGP的影响可反应药物促成骨细胞增殖及分化的能力。该研究结果显示， 药物B、C、D组分均能显著促进细胞内Ca2+的分泌、升高细胞中BGP 的含量（P<0.01），其中B组分的作用最显著。

该课题采用溶剂提取法对芭蕉根乙醇粗提取物，并通过水提醇沉和传统的萃取方法，获得芭蕉根A、B、C、D不同组分，且各组分通过高效液相色谱分析检测显示各个组分化学成分基本无明显交叉，表明组分制备合理。该研究结果显示B组分升高成骨细胞中 ALP、Ca2+、BGP含量的作用最显著，推测芭蕉根B组分促成骨细胞增殖与分化的作用可能与其所富含的蒽醌、黄酮类化合物有关，而其有效成分还有待进一步的化学成分分离以及活性研究，以进一步阐明芭蕉根治疗骨科疾病的药效物质基础。

综上所述，B组分为芭蕉根促成骨细胞增殖及分化的有效组分，该结果提示芭蕉根B组分可能通过升高细胞内ALP、Ca2+的含量、促进BGP的分泌从而促成骨细胞增殖及分化。

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（收稿日期：2019-03-29）