右美托咪定对体外循环下心内直视手术患儿外周血中性粒细胞凋亡的影响及机制

郭琼梅，刘秀叶，王莉，周晓辉，魏砚砚，毛瑞芬

(河北医科大学第一医院，石家庄050031)

体外循环(CPB)过程中中性粒细胞被大量激活，诱导呼吸爆发和全身炎症反应，造成组织损伤。中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂可通过降低体外循环患儿围术期白细胞和中性粒细胞水平而减轻全身炎症反应[1]。凋亡是中性粒细胞从炎性部位清除的主要方式。研究表明，CPB过程中血浆促炎症因子的增加与中性粒细胞凋亡减少呈正相关，中性粒细胞凋亡减少与其细胞膜上死亡受体(Fas)表达下调、细胞内B细胞淋巴瘤2蛋白(Bcl-2)的表达上调有关[2]。右美托咪定是高选择性α2受体激动剂，具有镇静、镇痛和抗交感作用，而人中性粒细胞膜可表达α2受体[3]。研究证实，右美托咪定可以减轻CPB患儿的全身炎症反应[4,5]。而右美托咪定对CPB过程中性粒细胞凋亡的影响尚不清楚。本研究对此作了探讨，为临床减轻CPB炎症反应提供依据。

1 资材料与方法

1.1 临床资料 2015年10月～2016年7月本院收治的室间隔缺损患儿60例，均于CPB下行心内直视修补术，男29例、女31例，年龄4～8岁，体质量14～28 kg，ASA分级Ⅱ、Ⅲ级;排除近1个月内急性感染、肝肾功能异常，重度贫血、近3个月内用皮质激素治疗。采用随机数字表法将患者分为对照组(C组)、右美托咪定组(Dex组)，各30例。C组男15例、女15例，年龄(5.2±1.3)岁，体质量(19±5)kg；Dex组男14例、女16例，年龄(5.0±1.2)岁，体质量(21±7)kg。两组临床资料具有可比性。研究已获本院伦理医学委员会批准，患儿监护人签署知情同意书。

1.2 麻醉方法 入室前30 min肌注东莨菪碱0.01 mg/kg。肌注氯胺酮4～6 mg/kg后入室，监测血压、心率、血氧饱和度，开放外周静脉通路，行桡动脉穿刺置管，持续监测平均动脉压。麻醉诱导：静脉注射咪唑安定0.15 mg/kg、舒芬太尼1 μg/kg、依托咪酯0.3 mg/kg、罗库溴铵0.6 mg/kg诱导，气管插管后行机械通气，氧流量2 L/min，潮气量10～12 mL/kg，吸呼比1∶2，维持PETCO2为35～45 mmHg。行右颈内静脉穿刺置管。麻醉维持：间断静脉注射舒芬太尼0.5～1 μg/kg、罗库溴铵0.3～0.6 mg/kg，持续输注丙泊酚4～6 mg/(kg·h)。CPB采用WEL-1000人工心肺机(天津汇康医用设备有限公司)和ODMO-100型膜式氧合器(西安岱岱生物医学工程有限责任公司)。羟乙基淀粉130/0.4、压积红细胞、冷冻血浆等预充，晶胶比(0.4～0.6)∶1。动脉流量80～120 mL/(kg·h)，术中维持MAP为40～60 mmHg。麻醉诱导后Dex组给予初始剂量0.5 μg/kg的盐酸右美托咪定注射液(江苏恩华药业股份有限公司)给药时间>10 min，继之以0.4 μg/(kg·h)的速率维持至术毕。C组给予等容量生理盐水。记录两组主动脉阻断时间、CPB时间。

1.3 标本采集 分别于CPB开始前(T1)、CPB开始后30 min(T2)、CPB停止后30 min(T3)和CPB停止后24 h(T4)采集桡动脉血5 mL，其中3 mL经肝素抗凝后，以3 000 r/min离心10 min，取上层血浆，-20 ℃保存。

1.4 中性粒细胞凋亡率及细胞膜上Fas表达、细胞内Bcl-2表达检测 采用Percoll密度梯度离心法分离中性粒细胞，瑞氏染色检验分离细胞的纯度，台盼兰检验细胞活性。用流式细胞仪观测中性粒细胞凋亡率。另外取各时点全血100 μL加入藻红蛋白(PE)标记的Fas荧光单克隆抗体，溶血素裂解红细胞，同时用鼠抗人PE标记IgG 2aκ作同型阴性对照，用流式细胞仪检测阳性细胞百分比。将分离的中性粒细胞悬于含10%胎小牛血清的1640培养液中，置于含5% CO2、37 ℃培养箱中培养24 h，破膜后加入异硫氰酸荧光素(FITC)标记的Bcl-2荧光单克隆抗体，同时用鼠抗人FITC标记IgG 2aκ作同型阴性对照，流式细胞仪检测阳性细胞百分比。

2 结果

2.1 两组主动脉阻断时间、CPB时间比较 C组主动脉阻断时间、CPB时间分别为(50±24)、(61±21)min，Dex组主动脉阻断时间、CPB时间分别为(42±25)、(58±24)min。两组主动脉阻断时间、CPB时间比较差异无统计学意义(P均>0.05)。

2.2 两组各时间点中性粒细胞凋亡率、Fas、Bcl-2表达比较 与T1比较，两组T2、T3、T4时中性粒细胞凋亡率均降低(P均<0.05)，T3时最低(P均<0.05)，Dex组T4时恢复至CPB开始前水平(P>0.05)；与C组比较，Dex组T3、T4时中性粒细胞凋亡率高(P均<0.05)。与T1比较，两组Fas阳性表达率T3、T4时均降低(P均<0.05)，T3时达最低(P均<0.05)；与C组比较，Dex组T3、T4时Fas阳性表达率高(P均<0.05)。与T1比较，两组中性粒细胞内Bcl-2阳性表达率T2、T3、T4时均升高(P均<0.05)，T3时达最高(P均<0.05)；与C组比较，Dex组在T2、T3、T4时Bcl-2阳性表达率低(P均<0.05)。见表1。

表1 两组中性粒细胞凋亡率、Fas、Bcl-2表达比较

2.3 相关分析 C组、Dex组中性粒细胞凋亡率均与CPB时间呈负相关(r分别为-0.686、-0.675，P均<0.05)；C组、Dex组中性粒细胞膜上Fas阳性表达率与中性粒细胞凋亡率呈正相关(r分别为0.589、0.694，P均<0.05)；C组、Dex组中性粒细胞内Bcl-2阳性表达率与中性粒细胞凋亡率呈负相关(r分别为-0.592、-0.725，P均<0.05)。

3 讨论

中性粒细胞是机体介导炎症反应的重要效应细胞，在炎症早期阶段发挥重要的免疫防御作用，但过度的炎性反应会损伤正常的组织细胞。适时抑制中性粒细胞过强的效应或促进其凋亡有利于减轻炎症反应对机体的损伤。CPB过程中，血液与人工装置非生物表面直接接触、手术创伤、器官缺血再灌注、术中体温的改变以及血流动力学的急剧改变，可迅速启动炎性级联反应。血液中炎症介质大量增加，中性粒细胞被大量激活并释放弹性蛋白酶，造成组织细胞损伤，同时释放炎症因子，激发全身炎症反应，造成多器官功能衰竭[1]。

凋亡是中性粒细胞从炎性部位清除的主要方式，且对周围组织损伤最小。研究证实，CPB过程中，中性粒细胞凋亡率降低，并与CPB时间相关，进一步加重炎症反应[6]。本研究中，两组中性粒细胞凋亡率在CPB开始后的30 min最低。而右美托咪定组高于对照组，说明右美托咪定减少了CPB过程中中性粒细胞的凋亡，可能与右美托咪定的抗炎作用相关，研究表明，右美托咪定可以抑制CPB过程中核因子B(NF-κB)的活性，降低白细胞介素8(IL-8)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)等促炎因子的水平[7]。而IL-8、TNF-α等促炎因子可以通过不同的途径抑制中性粒细胞凋亡。NF-κB通过调控多种炎症介质及与凋亡相关基因的转录和表达来参与调控中性粒细胞的凋亡[8,9]。吴新海等[3]研究结果表明，右美托咪定对离体中性粒细胞的凋亡促进和呼吸爆发功能的抑制作用呈剂量依赖性，同时该研究是针对正常情况下的中性粒细胞，而不是过度炎症刺激状态。因此，临床常用剂量的右美托咪定不影响正常状态下中性粒细胞的凋亡，不影响机体的免疫防御，不增加手术患者的感染概率。而在本研究中CPB过度炎症反应状态下，右美托咪定加速了过度激活的中性粒细胞的凋亡。

中性粒细胞凋亡的途径主要包括外源性的死亡受体途径和内源性的线粒体途径。Fas是一种膜结合蛋白，是肿瘤坏死因子受体超家族成员。中性粒细胞通过表达Fas及其配体(FasL)，调控细胞凋亡，保持自身数量的稳定[10]。促炎因子IL-8通过抑制Fas和FasL的结合，抑制中性粒细胞的凋亡。本研究结果显示，CPB开始后两组中性粒细胞细胞膜上的Fas阳性表达率均降低，且与中性粒细胞凋亡率呈正相关，而右美托咪定组各时间点的表达率较对照组高。说明右美托咪定可能通过Fas/FasL途径上调CPB过程中中性粒细胞的凋亡率。

Bcl-2家族包括促凋亡和抗凋亡两类蛋白，成熟的中性粒细胞两种蛋白均有表达，CPB过程中NF-κB的激活导致抗凋亡蛋白表达增加。Bcl-2是抗凋亡基因，被认为是调控细胞凋亡的最后通路之一，通过阻止线粒体释放的细胞色素C等凋亡形成因子发挥抗凋亡作用[10,11]。本研究结果显示，CPB开始后至停止24 h，中性粒细胞细胞内的Bcl-2表达升高，右美托咪定组各时间点的表达较对照组降低。说明右美托咪定通过下调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，改善CPB导致的中性粒细胞凋亡。

综上所述，右美托咪定通过上调中性粒细胞膜上Fas表达和下调细胞内Bcl-2表达，减轻了CPB过程中中性粒细胞凋亡的抑制。本研究不足之处在于样本量小，同时需进一步探讨不同剂量右美托咪定对CPB心内直视手术患儿外周血中性粒细胞凋亡的影响。