sKlotho对高糖状态下小鼠成骨细胞增殖与分化的影响

吕秀娟，陈新，王艳，马小羽

(1沈阳市第四人民医院，沈阳110031；2中国医科大学附属第一医院)

糖尿病患者存在钙磷代谢紊乱，膳食不当进一步导致钙的不足。国内研究显示，糖尿病患者普遍存在骨密度降低，骨质疏松发病率升高[1,2]。糖尿病性骨质疏松症是一种继发性骨质疏松，是糖尿病患者发生的骨骼系统严重并发症。糖尿病患者常见的髋部骨折、腕部骨折及无明显临床症状的脊椎骨折，绝大多数是由骨质疏松所致[3]。因此探讨糖尿病性骨质疏松症的分子发病机制有重要意义。Klotho是抗衰老基因，Klotho蛋白以两种形式存在，一种是存在于细胞内的膜型Klotho蛋白(mKlotho蛋白)，另一种是存在于血、尿和脑脊液中的分泌型Klotho蛋白(sKlotho蛋白)。mKlotho蛋白只在表达Klotho的器官中发挥作用，其主要作用是作为纤维生长因子23的辅因子调节机体内钙磷代谢，从而影响骨代谢。sKlotho在肿瘤、心血管及神经系统中具有抗氧化应激作用，在血管内皮细胞中能抑制P53/P21通路发挥抗衰老作用[4,5]。但对于sKlotho在骨代谢中的作用及机制尚无相关报道。因此，2017年1月～2018年12月，本研究对sKlotho在高糖状态下成骨细胞的作用进行探讨，为研究糖尿病性骨质疏松症发病机制及防治提供新靶点。

1 材料与方法

1.1 细胞、试剂及仪器 小鼠成骨细胞株MC3T3-E1(中国科学院细胞库)。改良型α-MEM培养基、1640培养基(美国Hyclone公司)，胎牛血清(德国PAN公司)，胰蛋白酶(美国GIBCO公司)，DMSO(美国Sigma公司)，sKlotho重组蛋白(美国CLOUD-CLONE CORP)，Lipofectamine 2000(美国Invitrogen)，CCK-8试剂盒(日本同仁化学研究所)，RIPA裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒(北京碧云天生物技术研究所)，兔抗小鼠ALP多抗、兔抗小鼠骨钙素(OC)多抗、兔抗小鼠Runt相关转录因子2(Runx2)多抗(美国Biotechnology)细胞培养箱(美国Thermo Forma Company)，低温离心机(科大创新股份有限公司)，低温高速离心机(美国Sigma公司)，高温灭菌器(日本Sanyo)，低温冰箱(日本Sanyo)，微量加样器(德国Ependoff)，倒置显微镜(日本Olympus)，酶标仪(美国BIOTEK)，电泳仪(美国BIO-RAD),凝胶成像系统(美国MicroChemi)。

1.2 溶液配制 高糖培养基：将葡萄糖溶解于100 mL含10%胎牛血清的改良型α-MEM培养基中，过滤，获得浓度为35 mmol/L的D-葡萄糖培养基。sKlotho重组蛋白原液：分别将0.01、0.02、0.1、0.2 μg的sKlotho晶体粉末溶解于1 mL双蒸水中，过滤后，得到相应浓度溶液，于-20 ℃保存。

1.3 细胞培养及分组 取MC3T3-E1细胞放于含10%胎牛血清改良型α-MEM培养基中，于37 ℃、5% CO2培养箱中培养，培养至融合度为50%～70%用于后续实验。将细胞随机分为高糖组、高糖+0.01 μg/mL sKlotho组、高糖+0.02 μg/mL sKlotho组、高糖+0.1 μg/mL sKlotho组、高糖+0.2 μg/mL sKlotho组，分别加35 mmol/L的葡萄糖与相应浓度sKlotho进行培养，观察sKlotho对高糖状态下MC3T3-E1细胞增殖与分化功能的影响。

1.4 MC3T3-E1细胞增殖能力检测 采用CCK-8实验。取各组细胞制成细胞悬液后接种于96孔板(每孔细胞悬液100 mL)，将细胞调整为每孔(6～10)×103个，每孔加入PBS 200 μL，每组设置5个复孔。于37 ℃、5% CO2培养箱中培养24 h，加入相应药物干预后，加入CCK-8试剂10 μL/孔，继续孵育2 h。用酶标仪测定波长450 nm处吸光度值(OD值)，用OD值表示MC3T3-E1细胞增殖能力。

1.5 MC3T3-E1细胞内分化蛋白Runx2、OC、ALP检测 采用Western blotting实验。裂解细胞并收集蛋白样品，用BCA法检测蛋白质浓度，制备上样样本，电泳，转模后将PVDF膜浸入TBST缓慢洗膜3次，每次10 min。将PVDF膜浸入封闭液(5% BSA)中，封闭2 h。用兔抗小鼠Runx2、OC、ALP、GAPDH孵育PVDF膜，均为1∶500，过夜(4 ℃)，取出PVDF膜，加入TBST缓慢洗膜3次，每次10 min；加入二抗(1∶8 000)孵育2 h，取出PVDF膜，加入TBST缓慢洗膜3次，每次10 min。检测目的蛋白的表达。

2 结果

2.1 sKlotho对高糖状态下MC3T3-E1细胞增殖能力的影响 干预72 h后，高糖组、高糖+0.01 μg/mL sKlotho组、高糖+0.02 μg/mL sKlotho组、高糖+0.1 μg/mL sKlotho组、高糖+0.2 μg/mL sKlotho组OD值分别为0.720±0.041、0.824±0.037、0.917±0.025、1.109±0.032、1.204±0.026。随着sKlotho浓度升高，OD值逐渐升高，高糖+0.2 μg/mL sKlotho组OD值最高，与高糖组比较差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2 不同浓度sKlotho对高糖状态下MC3T3-E1细胞分化能力的影响 随着sKlotho浓度升高，Runx2蛋白、OC蛋白、ALP蛋白表达水平逐渐升高，高糖+0.2 μg/mL sKlotho组Runx2蛋白、OC蛋白、ALP蛋白表达水平最高，与高糖组比较差异有统计学意义(P均<0.05)。见表1。

3 讨论

骨质疏松的发生与人体骨量有关。骨量即单位体积内骨组织(钙、磷等矿物质)、骨基质(如骨胶原、蛋白质、无机盐等)的含量。骨量越多，骨骼越强壮、坚硬，反之骨骼越脆，越容易断裂。成骨细胞可促进骨骼形成，而破骨细胞破坏旧骨骼。成骨细胞表面存在胰岛素受体，胰岛素对骨代谢可能有直接作用，胰岛素通过多种途径间接影响骨骼的重建。胰岛素生长因子(IGF)为多肽类生长因子，与成骨细胞与破骨细胞关系密切。IGF可作用于骨原细胞，刺激DNA合成，增加成骨细胞数目；调节成骨细胞的分化功能，增加成骨细胞的活性；调节骨吸收，抑制骨胶原的降解。前期研究发现,糖浓度在35 mmol/L时对MC3T3-E1细胞增殖及分化的抑制作用最强，高糖可显著抑制成骨细胞的增殖与分化。

表1 不同浓度sKlotho对高糖状态下MC3T3-E1细胞骨分化蛋白表达的影响

成骨细胞在成骨过程中经历增殖期、分细胞外基质成熟期及矿化期、凋亡期，在增殖与分化过程中，细胞内一系列基因会参与该过程，调控成骨细胞的增殖与分化。Runx2基因参与成骨细胞分化过程，调控骨钙素、骨桥蛋白、胶原酶3等基因的转录[6,7]；ALP是骨形成必需的酶，ALP基因在成骨细胞分化早期即开始表达，可作为成骨细胞外基质成熟的标志，是成骨细胞表型和分化的标志；矿化期为成骨细胞分化的晚期，此时OC等开始表达，OC是目前惟一只由成骨细胞产生的基质蛋白，是成骨细胞分化和成熟的标志蛋白。本研究发现，高糖干预后，MC3T3-E1细胞内Runx2蛋白、OC蛋白、ALP蛋白表达降低，高糖能够抑制MC3T3-E1细胞分化功能。

研究发现，糖尿病患者与大鼠中sKlotho表达减少。sKlotho基因变异小鼠寿命明显缩短，出现早衰现象，如发育迟缓、认知障碍、运动神经元退化、听力下降及骨量减少，且发生多种钙磷代谢紊乱。sKlotho是一种细胞因子，可通过调节多条细胞通路发挥作用，如抗OS、抗炎，而敲除sKlotho基因后小鼠发生骨代谢异常[8,9]

目前关于sKlotho的研究多集中于心血管疾病、慢性肾疾病、肿瘤及神经系统疾病等，sKlotho可调节钙离子通道活性[10]，调节胰岛素/IGF-1信号通路[11]，抗氧化应激[12]，调节Wnt信号通路[13]及炎症细胞因子[14]，而在骨代谢中的研究较少。因此，本研究探讨高糖状态下sKlotho对小鼠成骨细胞MC3T3-E1增殖与分化的影响。为观察高糖状态下MC3T3-E1细胞增殖及分化的变化，本研究设置了0.01、0.02、0.1、0.2 μg/mL四个浓度的sKlotho，发现随着sKlotho浓度升高，其对小鼠成骨细胞MC3T3-E1增殖与分化的改善作用越强，sKlotho浓度为0.2 μg/mL时作用最强。说明一定浓度的sKlotho对高糖状态下MC3T3-E1细胞的增殖能力、分化能力有改善作用。

综上所述，sKlotho对高糖状态下MC3T3-E1细胞的增殖与分化有改善作用，为糖尿病性骨质疏松症的临床诊治提供了新靶点。但本研究也有不足之处，未进一步探讨sKlotho的作用机制，仅探讨4组浓度sKlotho的干预效果，将来可扩大浓度范围并进一步探讨其作用机制。