VAP患者CRE医院感染分子流行病学特征及影响因素

张昭勇，高波，李显东，张吉才

(十堰市太和医院·湖北医药学院附属医院，湖北十堰442000)

肠杆菌科细菌是医院感染最常见的病原菌，其中碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌(CRE)因对多种临床常用抗菌药物有很高的耐药性而越来越受到关注。有研究发现，CRE的感染与患者发病率、病死率有关，特别是在危重患者中尤为明显[1]。临床多用大剂量美罗培南联合多黏菌素治疗CRE引起的呼吸机相关性肺炎(VAP)，但随着耐多黏菌素菌株的出现，使CRE感染的临床治疗越来越困难[2]。近年来在全世界范围内均出现对碳青霉烯类抗菌药物敏感性下降或耐药的菌株。目前，国内对VAP患者CRE感染分子流行病学特征、医院感染危险因素的研究较少。本研究对此作了探讨，为感染患者的防护和治疗提供依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2016年1月～2018年6月本院收治的VAP患者58例，均为非重复CRE感染患者(CRE感染组)。另外按照1∶2比例选取同期(15 d内)116例VAP患者作为对照组，均为非CRE肠杆菌科细菌感染的患者，其中肺炎克雷伯菌62例、大肠埃希菌30例、阴沟肠杆菌17例、产酸克雷伯菌5例及枸橼酸杆菌2例。VAP诊断标准：使用呼吸机48 h后发生肺部感染，并结合临床表现、影像学检查、病原学检查确诊。患者对本研究均知情同意。

1.2 细菌鉴定及药物敏感性检测 患者早上用温开水漱口清除口腔内杂菌，然后用力从气管深部咳出痰液，吐入广口带盖的无菌容器内送检。按全国临床检验操作规程进行菌株分离培养，使用DL-96细菌测定系统进行细菌鉴定。按照2015年美国临床实验室标准化协会(CLSI)推荐的MIC法进行药物敏感试验和结果判断。

1.3 碳青霉烯酶表型筛查 美罗培南或亚胺培南MIC≥2 mg/L为CRE感染的判定标准。用改良碳青霉烯灭活实验(mCIM)和乙二胺四乙酸碳碳青霉烯类失活法(eCIM)进行检测。mCIM实验操作步骤：取接种环待测细菌1 μL置于2 mL TSB肉汤中；振荡混匀后每管放入一张含10 μg美罗培南的无菌纸片，于35 ℃孵育4 h。用生理盐水制备0.5 Mc的大肠埃希菌ATCC 25922悬液；将美罗培南纸片从TSB肉汤中取出，挤去纸片上多余水分，然后将纸片贴于已涂有大肠埃希菌的MHA平板上，于35 ℃大气环境孵育24 h量取抑菌圈直径。eCIM实验操作步骤：取第2支含2 mL TSB的肉汤管，加入20 μL EDTA溶液,其余步骤同mCIM实验。mCIM与eCIM实验同步进行。mCIM和eCIM实验管中的美罗培南纸片贴于同一块已涂有大肠埃希菌的MHA平板上。mCIM结果判断标准：抑菌圈直径为6～15 mm或直径为16～18 mm但抑菌圈内有散在菌落为阳性；抑菌圈直径≥19 mm为阴性；抑菌圈直径为16～18 mm，或直径≥19 mm但抑菌圈内有散在菌落为结果无法判断。eCIM阳性结果判断标准：与mCIM结果相比，美罗培南抑菌圈直径≥5 mm。

1.4 CRE耐药基因检测 采用PCR法。加热裂解法提取细菌DNA，PCR扩增细菌耐药基因。引物(由武汉安基生物科技有限公司合成)序列见表1。PCR扩增体系：ddH2O 20 μL，引物2 μL，2×PCR Master 25 μL，DNA 1 μL。反应条件：94 ℃变性5 min，94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，35个循环，72 ℃延伸5 min，2%琼脂糖凝胶电泳分离产物。

表1 耐药基因引物

1.5 统计学方法 采用SPSS19.0统计软件。计数资料比较采用χ2检验；对CRE感染影响因素进行单因素分析，筛选可能的危险因素，以可能的危险因素作为自变量，进行多因素非条件Logistic回归分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CRE感染病原菌分布 从483例VAP患者中检出58株非重复CRE菌，其中肺炎克雷伯菌最为常见26株(44.8%)，其次是大肠埃希菌15株(25.8%)、阴沟肠杆菌8株(13.8%)、产酸克雷伯菌7株(12.1%)、弗氏枸橼酸杆菌1株(1.7%)、黏质沙雷菌1株(1.7%)。

2.2 CRE感染患者科室分布 58例医院感染患者分布于ICU 18例(31.0%)，其中感染肺炎克雷伯菌9例、大肠埃希菌5例、产酸克雷伯菌3例、弗氏柠檬酸杆菌1例；神经外科10例(17.2%)，其中感染肺炎克雷伯菌2例、大肠埃希菌3例、阴沟肠杆菌3例、产酸克雷伯菌3例；呼吸内科16例(27.6%)，其中感染肺炎克雷伯菌6例、大肠埃希菌3例、阴沟肠杆菌4例、产酸克雷伯菌2例、黏质沙雷菌1例；泌尿外科2例(3.4%)，均为大肠埃希菌感染；骨科1例(1.7%)，为肺炎克雷伯菌感染；老年医学科4例(6.9%)，均为肺炎克雷伯菌感染；儿科3例，其中感染肺炎克雷伯菌2例、大肠埃希菌3例；肿瘤科2例，分别为肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌感染。

2.3 CRE的药物敏感性 测试菌对头孢哌酮/舒巴坦、头孢呋辛、头孢唑啉、头孢他啶、氨苄西林、头孢吡肟、头孢西丁、氨苄西林/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦、替卡西林/克拉维酸和环丙沙星均100%耐药。敏感的抗生素药敏结果见表2。

表2 CRE的药物敏感性

2.4 碳青霉烯酶表型 58株CRE仅mCIM阳性23株，mCIM与eCIM均阳性30株，mCIM与eCIM均阴性3株，无法判断2株。

2.5 CRE相关耐药基因分布 肺炎克雷伯菌、大肠杆菌、阴沟肠杆菌及产酸克雷伯菌均检测出不同种类的耐药基因，弗氏柠檬酸杆菌、黏质沙雷氏菌未检测出耐药基因。见表2。

2.6 CRE感染的危险因素

表2 CRE相关耐药基因分布(%)

2.6.1 单因素分析结果 两组入住ICU>7 d、用β-内酰胺酶抑制剂抗生素、碳青霉烯类抗生素、联合用药、神经损伤比例比较差异有统计学意义(P均<0.05)。见表3。CRE感染组、对照组住院时间分别为(36±6.6)、(15±5.2)d，病死率37.9%(22/58)、11.2%(13/116)。与对照组比较，CRE感染组住院时间长(P<0.05)、病死率高(P<0.05)。

2.6.2 多因素分析结果 将两组单因素分析差异有统计学意义的5个因素纳入Logistic回归分析，结果显示入住ICU>7 d(OR=3.431， 95%CI1.251～4.152)、含β-内酰胺酶抑制剂抗生素使用(OR=3.018，95%CI1.102～5.394)、碳青霉烯类抗生素使用(OR=5.232，95%CI2.579～7.561)是VAP患者CRE医院感染的独立危险因素。

3 讨论

CRE感染率近年来呈不断升高趋势，越来越引起临床重视[3]，尤其是质粒介导产碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌酶的碳青霉烯耐药菌株在世界范围内广泛流行。CRE作为医院感染的重要病原菌，可明显增加患者病死率。对CRE的分子流行病学特征及感染危险因素进行探讨，并评估CRE对临床常用药物的敏感性，可为临床抗感染治疗方法选择和CRE流行播散控制提供依据。

表3 CRE感染危险因素单因素分析(例)

本研究分离的非重复CRE菌58株，其中肺炎克雷伯菌最为常见，其次是大肠埃希菌、阴沟肠杆菌，这与我国CRE的流行情况一致[4]。ICU是CRE感染最常见的科室，其次是呼吸内科、神经外科。原因可能为以上科室患者抗生素使用量大、侵入性操作多、患者免疫力低。因此，对上述重点科室的感染控制可能有利于防止CRE的播散。

肠杆菌科细菌对碳青霉烯类药物耐药的机制比较复杂。目前研究表明，CRE最主要的耐药机制是产碳青霉烯酶。mCIM和eCIM是CLSI推荐的检测碳青霉烯酶表型的筛查方法。mCIM用于检测肠杆菌科细菌和铜绿假单胞菌中的碳青霉烯酶，而eCIM与mCIM联合用来区分产金属酶(Ambler B类)和产丝氨酸碳青霉烯酶(Ambler A类)的肠杆菌科细菌。本研究结果显示，产Ambler B类金属酶和Ambler A类丝氨酸碳青霉烯酶是CRE的主要耐药机制，这与董爱英等[5]报道的以丝氨酸碳青霉烯酶为主有所差异，可能是不同地区耐药基因流行有差异。

本研究中58株CRE均表现为多重耐药，其中7株表现为泛耐药，未发现全耐药菌株。菌株对目前临床常用抗菌药物如头孢哌酮/舒巴坦、头孢呋辛、头孢唑啉、头孢他啶、氨苄西林、头孢吡肟、头孢西丁、氨苄西林/舒巴坦均100%耐药。多黏菌素B是研究中针对CRE最为敏感的抗生素(敏感率100%)，因此联合用药治疗CRE感染推荐多黏菌素B作为首选药物之一。米诺环素(敏感率55.2%)、阿米卡星(敏感率48.3%)和复方新诺明(敏感率43.1%)在体外药物敏感试验中对CRE也具有较高的敏感性。阿维巴坦作为新一代β-内酰胺酶抑制剂对A类丝氨酸碳青霉烯酶具有抑制作用，但对B类金属酶缺乏活性[6]。虽然头孢他啶/阿维巴坦治疗CRE感染有良好的效果，但是本研究中金属酶作为CRE株最主要的耐药酶限制了该类药物的使用。

本研究针对CRE的分子检测及遗传特性分析发现，碳青霉烯酶基因和ESBLs基因是最主要的耐药机制。52株细菌碳青霉烯酶基因阳性，其中30株NDM-1基因阳性，24株KPC/KPC-2基因阳性，2株IMP基因阳性，有4株肺炎克雷伯菌同时检测出NDM-1和KPC耐药基因，而2株IMP基因阳性菌均为产酸克雷伯。不同耐药基因在各个菌种间分布存在差异，在肺炎克雷伯菌中最主要的是KPC-2，而在大肠埃希菌中最主要的是NDM-1。值得注意的是以往国内研究报道中NDM-1耐药基因在肺炎克雷伯菌中较为少见[7]，但本研究发现34.6% 的菌株携带NDM-1耐药基因，并且有4株肺炎克雷伯同时检测出NDM和KPC耐药基因，这可能与地方流行有关。提示应该关注NDM耐药基因在本地区的流行播散。IMP基因在有些地区报道较为普遍，但在中国较为少见，仅在产酸克雷伯中发现2株[8]。OXA-48型耐药基因在欧洲较常见，在本研究中尚未发现该类耐药基因。在检测到的ESBL耐药基因中，CTX-M型特别是CTX-M-9型最为常见，其次是TEM型和SHV型超广谱 β-内酰胺酶基因，这与中国ESBL耐药基因的流行基本一致[9]。

抗生素的选择压力是细菌产生多重耐药性的一个重要因素。有研究表明，碳青霉烯类抗生素对肠杆菌科细菌的选择压力有利于筛选出产碳青霉烯酶株，从而导致CRE株的大量产生[10]。β-内酰胺酶抑制剂广谱抗生素使用易产生CRE的原因包括抗生素的筛选作用和β-内酰胺酶抑制剂的诱导作用。有研究显示，联合使用抗生素是CRE感染的危险因素[11]，但在本研究中并非CRE感染的危险因素。这表明导致CRE感染较高的主要因素可能是使用了含β-内酰胺酶抑制剂广谱抗生素和碳青霉烯类抗生素，而联合用药本身只是其混杂因素。ICU入住>7 d是感染CRE的另一个重要危险因素，其原因是ICU患者住院时间越长，发生院内感染的概率就越高；并且抗生素使用频繁，侵入性操作多，导致接触耐药菌的机会就多，病原菌耐药情况就更加严重。所以应根据抗菌药物敏感试验选择抗生素，从而减少CRE耐药菌株的产生。本研究还发现，CRE感染组病死率高于对照组，平均住院时间较对照组长。

总之，VAP患者医院感染CRE株耐药性强，患者病死率高。入住ICU>7 d及使用含β-内酰胺酶抑制剂抗生素、碳青霉烯类抗生素的VAP患者易感染CRE。因此，加强临床抗菌药物的管理和应用，隔离防护ICU患者、规范临床操作是控制和预防CRE播散的有效方法。