活动期全身型幼年特发性关节炎患儿外周血Th17/Treg的变化及意义

孙广超，曾华松

(广州市妇女儿童医疗中心，广州510180)

幼年特发性关节炎(JIA)是儿童常见的以慢性关节滑膜炎为主的自身免疫性疾病，发病原因可能涉及遗传、环境、免疫紊乱等多种因素[1,2]。全身型JIA(SJIA)以发热、皮疹、关节炎等全身症状为主要表现，发病率约占JIA的10%，如诊治不及时，可致患儿残疾[3]。SJIA发病原因和机制尚无统一定论，目前临床确诊主要依靠临床表现和实验室检查。但SJIA临床表现特异性差，其他JIA亚型也可表现为与SJIA相似的临床症状体征；实验室指标如抗可溶性核抗原、抗核抗体、类风湿因子等用于诊断SJIA的灵敏度和特异度较差[4]。寻找其他有效、方便的方法辅助诊断SJIA已成为研究的热点。研究发现，初始辅助性T细胞(Th细胞)在细胞因子介导下可分化为Th17和调节性T细胞(Treg)等亚群，并发挥不同的生物学功能。Th17细胞促进炎症反应发生，并与自身免疫性疾病、恶性肿瘤发病密切相关；Treg细胞主要有免疫负调控并抑制自身免疫性疾病发生、维持自身免疫耐受等功能[5,6]。正常情况下，Th17/Treg处于动态平衡。研究发现，Th17/Treg失衡参与了JIA发病过程[7]。但在SJIA发病过程中Th17/Treg的作用，目前研究相对较少。本研究探讨SJIA活动期患儿外周血Th17/Treg的变化，探讨其在SJIA发病过程中的作用及其与疾病活动性的关系。

1 资料与方法

1.1 临床资料 收集2015年12月～2018年12月本院门诊和住院治疗的SJIA活动期患儿93例，男54例，女39例；年龄4～16(8.93±5.57)岁；病程0.3～3.6(1.82±0.95)年；28处关节疾病活动度(DAS28)评分2.9～11.2(5.79±3.22)分。根据DAS28评分[8]将患者分为低度活动组(n=39，2.6分5.5分)。纳入标准：符合国际风湿病学联盟儿科专家组制订的关于SJIA的诊断标准[9]；符合SJIA活动期诊断，即有关节症状如关节肿胀、疼痛等，同时包含全身红斑、关节触痛、发热、关节活动受限中的至少1项，C反应蛋白(CRP)、红细胞沉降率(ESR)升高且DAS28>2.6分；符合医学伦理学要求；患儿家属签署知情同意书。排除标准：心、肝、肾功能障碍；血液系统疾病；其他可能影响本研究结果的自身免疫性疾病；急慢性感染；恶性肿瘤。同期随机选取50例SJIA缓解期患儿(缓解组)、50例体检健康儿童(健康对照组)为对照。缓解组男29例，女21例；年龄4～15(8.27±6.04)岁；病程0.5～3.3(1.76±1.02)年；纳入标准：符合SJIA缓解期诊断标准，即患儿治疗6个月后临床症状缓解，CRP、ESR恢复正常，DAS28评分<2.6分，2个月内无活动期相关临床症状。健康对照组男31例，女19例；年龄5～16(8.56±5.92)岁。各活动组、缓解组性别、年龄、病程具有可比性，各活动组、缓解组、健康对照组性别、年龄具有可比性。

1.2 Th17细胞、Treg细胞比例及Th17/Treg检测 采集活动期患儿入院次日、缓解组入院当日与健康对照组体检时清晨空腹肘静脉血5 mL，用肝素钠100 μL进行抗凝，并加入鼠抗人PerCP-抗CD3、FITC-抗CD4、PE-抗CD8抗体20 μL，4 ℃环境下孵育30 min，加入NH4Cl溶血剂4 mL进行溶血，以磷酸缓冲盐溶液(PBS)洗涤2次后进行检测。将经过肝素钠抗凝后的全血与RPMI1640培养液混匀，比例为1∶1，在CO2培养箱中，室温环境下培养4 h，备好细胞等分测定管以及同型对照管，加入PerCP-抗CD3、FITC-抗CD8抗体，在4 ℃环境下避光孵育30 min，PBS洗涤2次，用固定液在37 ℃环境下避光反应15 min，弃上清液，以PBS洗涤2次，加入破膜剂、FE标记抗人白细胞介素17A(IL-17A)单抗，细胞内染色，用PBS洗涤2次后进行检测。在肝素钠抗凝血中加入经PerCP标记的CD4单克隆抗体、经FITC标记的CD25，并将其作为测定管，同时设立同型对照管。采用流式细胞术检测Th17细胞、Treg细胞占CD4+T细胞的比例，计算Th17/Treg值。FACScan流式细胞仪购于美国Becton-Dickinson公司。

1.3 细胞因子检测 参照1.2抽取各组空腹肘静脉血5 mL，以3 000 r/min离心5 min，离心半径为12 cm，留取血清置于-20 ℃环境下保存，留待检测。采用酶联免疫吸附法测定血清中白细胞介素6(IL-6)、IL-17、IL-10、转化生长因子(TGF-β1)水平。IL-6检测试剂盒购自比利时Innogentics公司，IL-10、IL-17、TGF-β1检测试剂盒购自美国R&D Systems公司。严格按照试剂盒相关说明进行操作。

2 结果

2.1 各组外周血Th17细胞、Treg细胞比例及Th17/Treg值比较 各组外周血Th17细胞、Treg细胞比例及Th17/Treg值比较见表1。

表1 各组外周血Th17细胞、Treg细胞比例及Th17/Treg值比较

注：与缓解组、健康对照组比较，*P<0.05；与低度活动组比较，#P<0.05；与中度活动组比较，▲P<0.05。

2.2 各组血清细胞因子水平比较 各组血清IL-6、IL-17、TGF-β1、IL-10水平比较见表2。

表2 各组血清细胞因子水平比较

注：与缓解组、健康对照组比较，*P<0.05；与低度活动组比较，#P<0.05；与中度活动组比较，▲P<0.05。

2.3 SJIA活动期患儿血清细胞因子水平的相关性 经Pearson积矩相关分析结果显示，SJIA活动期患儿血清IL-6、IL-17水平与IL-10水平呈负相关(r分别为-0.537、-0.612，P均<0.05)，与TGF-β1水平呈正相关(r分别为0.416、0.509，P均<0.05)。

2.4 SJIA活动期患儿血清细胞因子水平与DAS28评分的相关性 经Pearson积矩相关分析结果显示，SJIA活动期患儿血清IL-6、IL-17、TGF-β1水平与DAS28评分呈正相关(r分别为0.692、0.725、0.607，P均<0.05)，IL-10水平与DAS28评分呈负相关(r=-0.624，P<0.05)。

3 讨论

SJIA病情复杂，常伴有不同程度急性炎症反应，诊治不及时可伴发巨噬细胞活化综合征，并损伤全身多个器官，病死率较高，预后较差。随着生物制剂在临床的广泛使用，SJIA的病死率虽有下降，但仍有部分患儿发生慢性疼痛及残疾[10,11]。进一步研究SJIA发病原因及机制是临床热点，也对辅助临床诊断并制订针对性治疗方案具有重要意义。Th17细胞、Treg细胞是由初始T细胞分化而来，两者具有相反的分化方向，发挥相反的功能。正常情况下，两者处于动态平衡以维持机体的免疫稳定[12]。Th17细胞主要发挥促炎作用，IL-17A还可与肿瘤坏死因子α(TNF-α)、TGF-β等炎性细胞因子结合，共同诱导并促进其他具有炎性活性的基因表达，以发挥促炎作用，使炎性细胞浸润并损伤组织。Treg细胞主要在自身反应性T细胞的免疫抑制过程中发挥重要作用，通过限制免疫应答的效力和强度来减轻免疫反应所致的组织损伤。谭艳芳等[13]研究表明，Th17、Treg细胞及Th17/Treg失衡介导了巨细胞病毒感染发病的免疫机制，并且IL-6、IL-10、IL-17等相关细胞因子与病毒的潜伏-激活状态密切相关。研究发现，Th17/Treg失衡参与了慢性阻塞性肺疾病发病、风湿免疫性疾病、强直性脊柱炎发病过程[14～16]。JIA发病与Th17/Treg失衡密切相关，同时相关细胞因子还介导了JIA患儿的关节损害[17]。免疫反应失调和免疫复合物沉积在SJIA发病过程中发挥重要作用。

本研究结果显示，SJIA活动期患儿Th17细胞比例、Th17/Treg值升高，且明显高于SJIA缓解期患儿、健康儿童；Treg细胞比例明显下降。提示Th17/Treg失衡与SJIA发病密切相关，并证实其介导了SJIA免疫机制，与有关研究[11]结果相似。随着SJIA活动度增加，患儿Th17细胞比例、Th17/Treg值均逐渐升高，Treg细胞比例逐渐降低。可见Th17/Treg是反映SJIA疾病活动的重要标志物，早期对其进行检测可评估病情活动度，从而为临床诊断和治疗提供指导。结果还发现，SJIA活动期患儿IL-6、IL-17、TGF-β1水平高于缓解组与健康对照组，IL-10水平低于缓解组与健康对照组。IL-6、IL-17是由Th17细胞合成并分泌的细胞因子，其中IL-6作为促炎因子可使机体T细胞激活而加剧炎性反应，导致机体出现炎症损伤；IL-17是强致炎因子，不仅可以激活T细胞和刺激内皮细胞、上皮细胞以及成纤维细胞等,并产生IL-6、IL-8等细胞因子而致炎症发生，同时还可促进前炎性细胞因子的释放以加剧炎症反应[18]。活动度越强的患儿，IL-6、IL-17水平越高，提示Th-17分泌的炎性细胞因子参与了SJIA发展过程。TGF-β1主要由Treg细胞分泌，本研究发现患儿活动度越强，其水平越高。可能是因为SJIA活动期炎症反应加重，可促进TGF-β1的水平升高；同时，TGF-β1又可促进Th17分化，导致Th17/Treg失衡，如此反复循环。IL-10是由Treg细胞分泌，具有抗炎功能，并抑制促炎细胞因子的合成。本研究结果显示，SJIA患儿外周血中IL-10水平降低，疾病活动度越强，其水平越低。这与Treg细胞比例变化一致。通过调控IL-10水平可能抑制Th17水平，这为临床治疗SJIA提供了思路。上述结果提示炎性细胞因子参与了SJIA发生发展过程，早期对其进行检测对判断疾病活动度及制订诊疗方案具有重要价值。

另外，IL-6、TGF-β1在Th17细胞与Treg细胞连接中发挥关键作用。当TGF-β1单独刺激时可促进Foxp3+Treg细胞的分化，当其与IL-6共同作用时，可促进RoRγt基因的表达，并进一步促进Th17细胞的分化。本研究中，SJIA活动期患儿Th17细胞分泌的促炎细胞因子IL-6、IL-17水平与Treg细胞分泌的抗炎因子水平呈负相关，与TGF-β1呈正相关。提示细胞因子可能是导致Th17/Treg失衡的关键，也是引起免疫机制紊乱的始动因素，早期检测细胞因子水平可反映Th17/Treg的稳定情况。此外，结果发现SJIA活动期患儿细胞因子IL-6、IL-10、IL-17、TGF-β1与DAS28分值呈不同程度相关性，说明早期检测Th17/Treg相关细胞因子，可作为临床评估病情活动度的重要指标。

综上所述，Th17细胞比例上升、Treg细胞比例下调、Th17/Treg失衡参与了SJIA的发生发展过程。Th17、Treg相关细胞因子参与了SJIA活动期的免疫机制，有望作为临床评估患儿病情的重要标记物。本研究样本量较小且为回顾性研究，建议开展大样本队列研究进一步探讨Th17/Treg在活动期SJIA发病过程中的作用。