口腔鳞状细胞癌RASSF5A基因的甲基化及临床意义

尹克，李天客，郭杰，张冠华，徐金荣

(1邢台市人民医院，河北邢台054001；2河北医科大学第四医院)

口腔癌是头颈部肿瘤中最常见的恶性肿瘤之一，其主要组织学类型为鳞状细胞癌(鳞癌)。由于其早期症状不明显，发现时大多患者已发生局部淋巴结转移，因此预后较差，5年生存率较低。另外，由于口腔部位解剖复杂，肿瘤不能根本切除，口腔癌的复发率高达35%[1～3]。研究显示Ras相关区域家族5A(RASSF5A)基因在多种恶性肿瘤中扮演抑癌基因的角色，且其启动子区的甲基化是导致RASSF5A沉默的机制之一[4～9]。本研究通过分析RASSF5A基因在口腔鳞癌组织及细胞中的甲基化状态，探讨RASSF5A基因甲基化与口腔鳞癌发生发展、预后的关系。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2011年1月～2013年12月于河北医科大学第四医院口腔科初次就诊的口腔鳞癌患者49例，男28例，女21例；年龄25～79岁，平均59.3岁；饮酒24例，吸烟26例；高、中分化32例，低分化17例；淋巴结转移31例，无淋巴结转移18例；临床分期Ⅰ、Ⅱ期19例，Ⅲ、Ⅳ期30例。患者均给予手术治疗，术中切取口腔鳞癌组织及相应的口腔正常黏膜组织(距癌组织2.5 cm)，均经病理检查证实，均于离体半小时内置液氮中保存。患者术前均未接受放疗、化疗，且无合并影响本研究结果的疾病。本研究通过医院伦理委员会审查批准，患者及家属均签署知情同意书。对患者采用电话或门诊复诊的形式进行随访，每半年1次，随访截止至患者死亡或2019年1月28日。

1.2 口腔癌细胞来源及培养 口腔癌细胞系OC3、KB均由河北医科大学第四医院口腔科保留并传代。细胞均采用常规方法进行培养，同时采用5-氮杂-2′-脱氧胞苷(5-Aza-dC，Sigma公司)终浓度5 μmol/L，进行处理，隔24 h更换培养液，培养96 h，第4天换全血清培养基培养24 h后收集细胞。

1.3 组织及细胞中RASSF5A基因甲基化检测 采用甲基化特异性PCR(MSP)技术。采用酚-氯仿抽提法提取新鲜组织及5-Aza-dC处理前后的口腔癌细胞系中的DNA，重亚硫酸盐转化，经重亚硫酸盐转化后的DNA进行PCR扩增，用扩增出的产物行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳条带的结果来分析目的基因甲基化状态。经亚硫酸盐(德国QIAGEN公司)进行处理后，单链DNA未甲基化胞嘧啶可以被亚硫酸氢盐脱氨基进而转变为尿嘧啶，而甲基化胞嘧啶不能够被修饰。应用Methprimer软件设计甲基化与非甲基化引物，甲基化上游引物序列：5′-ATTTACGGGATAAAGCGCGGTTGCG-3′，下游引物序列：5′-TAAACGTCCGCTCGCCACTCTCCCG-3′，产物大小169 bp。非甲基化上游引物序列：5′-ATTTATGGGATAAAGTGTGGTTGTG-3′，下游引物序列：5′- TAAACATCCACTCACCACTCTCCCA-3′，产物大小169 bp。引物由北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司合成。PCR反应条件：95 ℃预变性10 min；94 ℃变性45 s，54 ℃(甲基化)、57 ℃(非甲基化)退火45 s，72 ℃延伸45 s，共35个循环；72 ℃再延伸7 min。甲基化状态判定：①甲基化：甲基化特异性引物(M)扩增出目的条带，而非甲基化特异性引物(U)未扩增出目的条带；②非甲基化：非甲基化特异性引物(U)扩增出目的条带，而甲基化特异性引物(M)则未扩增出目的条带；③不完全甲基化：两对引物均扩增出目的条带，并将其记入甲基化状态。

1.4 组织及细胞中RASSF5A mRNA表达检测 采用RT-qPCR技术。按照TRIzol(美国SBS公司)试剂说明书从新鲜组织及5-Aza-dC处理前后的口腔癌细胞系中提取RNA，按反转录试剂盒(美国Promega 公司)说明书将提取的RNA反转录为cDNA，分别加入RASSF5A引物和GAPDH引物，扩增cDNA，将得到的PCR产物用2%琼脂糖凝胶进行电泳，以GAPDH作为内参照。RASSF5A上游引物序列：5′-GAGTAGCGCAGTCGCCAAAG-3′，下游引物序列：5′-GCTCGGGGTCCAATAGTAGC-3′，产物大小115 bp；GAPDH上游引物序列：5′-AGGTGAAGGTCGGAGTCAACG-3′，下游引物序列：5′-AGGGGTCATTGATGGCAACA-3′，产物大小104 bp。引物由北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司合成。95 ℃预变性10 min；94 ℃变性45 s，56 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，共40个循环；72 ℃再延伸7 min。每个样本分别设3个复孔。采用2-ΔΔCT法计算目的基因的相对表达量。

2 结果

2.1 组织中ASSF5A mRNA表达及甲基化情况 口腔鳞癌组织及正常黏膜组织中RASSF5A mRNA相对表达量分别为0.279±0.124、1.016±0.109，甲基化率分别为51.0%(25/49)、22.4%(11/49)。口腔鳞癌组织中RASSF5A mRNA相对表达量低于口腔正常黏膜组织(P<0.05)，甲基化率高于口腔正常黏膜组织(P<0.05)。

2.2 细胞中RASSF5A mRNA表达及甲基化情况 5-Aza-dC处理前OC3、KB细胞中RASSF5A mRNA相对表达量分别为1.010±0.175、1.002±0.125，5-Aza-dC处理后OC3、KB细胞中RASSF5A mRNA相对表达量分别为3.550±0.525、2.440±0.301。5-Aza-dC处理后，OC3、KB细胞中RASSF5A mRNA相对表达量较处理前升高(P均<0.05)，甲基化程度降低。

2.3 RASSF5A基因甲基化与患者临床病理参数的关系 RASSF5A基因甲基化率与肿瘤淋巴结转移、TNM分期有关(P均<0.05)，与患者性别年龄、吸烟、饮酒、肿瘤分化程度无关(P均>0.05)。见表1。

表1 RASSF5A基因甲基化与患者临床病理参数的关系[例(%)]

2.4 RASSF5A基因甲基化与口腔鳞癌患者预后的关系 RASSF5A基因甲基化患者5年生存率为20.0%(5/25)，生存时间(26.60±3.20)个月；RASSF5A基因未甲基化患者生存率为33.3%(8/24)，生存时间(40.64±3.26)个月。二者生存率、生存时间比较差异有统计学意义(P均<0.05)。

3 讨论

RASSF5定位于染色体1q32.1，是RASSF基因家族的一员[10]，是Ras关联结构域家族的肿瘤抑制因子，具有Ras关联域和C-末端Salvador/Rassf/Hippo结构域(SARAH域)，是Ras结合蛋白[11，12]。RASSF5有3个转录本RASSF5A、RASSF5B和RASSF5C。研究发现，RASSF5A在多种肿瘤(胃癌、肺癌、肝癌、结肠癌等)组织中表达下调[4～7]。

本研究在口腔鳞癌组织中检测RASSF5A基因表达，结果显示口腔鳞癌组织中RASSF5A基因表达低于口腔正常黏膜组织，提示RASSF5A基因在口腔鳞癌组织中发挥重要作用。Steinmann等[13]发现，RASSF5A在头颈癌组织中可能表达下调，这与本研究结果相符。DNA甲基化是表观遗传学的重要组成部分，研究表明，DNA甲基化与口腔鳞癌的发生发展密切相关，口腔鳞癌组织和口腔癌前病变组织中DNA甲基化更频繁、水平更高[14，15]。本研究中未经5-Aza-dC处理的口腔癌细胞系中RASSF5A mRNA表达均较低；经5-Aza-dC处理后，口腔癌细胞系中RASSF5A mRNA表达均升高。提示可能由于表观遗传学改变导致RASSF5A基因在口腔鳞癌中表达下调。

研究发现，在多种肿瘤组织中发现了RASSF5A基因通过启动子区高甲基化介导的表观遗传学失活，包括胃癌[4]、肺癌[5]、肝癌[6]、结肠癌[7]、神经系统肿瘤[8]和食管癌[9]等。推断在口腔鳞癌中RASSF5A基因的表达沉默机制可能与RASSF5A启动子区甲基化状态有关。因此本研究采用MSP法对5-Aza-dC处理前后的口腔癌细胞系中RASSF5A基因启动子区的甲基化状态进行检测，结果显示KB细胞系中RASSF5A基因呈现不完全甲基化状态，而OC3细胞系中的RASSF5A基因则呈现出完全甲基化状态；同时对口腔鳞癌组织及相应癌旁组织中的RASSF5A基因启动子区甲基化状态进行研究，结果显示在口腔鳞癌组织中RASSF5A基因甲基化率高于相应的癌旁组织，提示RASSF5A启动子CpG岛高甲基化可能是口腔鳞癌中RASSF5A基因表达下调的主要机制之一。并且从RASSF5A基因甲基化状态和临床病理参数的分析发现，其甲基化率与口腔鳞癌患者有无淋巴结转移及TNM分期密切相关，进一步提示口腔鳞癌中的RASSF5A基因表达下调可能与RASSF5A基因甲基化有关。

本研究结果显示,RASSF5A在口腔鳞癌组织中的表达低于癌旁正常组织，其启动子区CpG岛的异常高甲基化状态可能是口腔鳞癌组织中RASSF5A表达下调的重要机制之一。研究[16]发现，通过对口腔鳞癌中关键基因的甲基化位点的检测，用于寻找可能成为口腔鳞癌早期诊断的分子标记物。因此对RASSF5A作用机制的进一步深入研究，有望为口腔鳞癌的早期诊断和预防提供更为精确的靶点。