宫颈癌组织中CXCL13、Dyrk1b蛋白表达变化及意义

吴丽，杨俊，唐真姿

(湖南省肿瘤医院，长沙410006)

宫颈癌是由人乳头瘤病毒感染引起的女性生殖系统恶性肿瘤，具有较强的侵袭性，易发生远处转移。晚期宫颈癌患者预后较差，其5年生存率仅为15%[1]，严重危害女性生命健康。近年来随着筛查技术的普及，可早期采取干预措施，对改善患者预后有积极意义，但宫颈癌的发病存在年轻化趋势。目前，手术根治性肿瘤切除、淋巴结清扫及辅助放化疗是临床最常见的宫颈癌治疗方法，虽然在一定程度上降低了患者病死率，但术后复发及转移仍是影响预后的重要因素。因此，寻找与宫颈癌发生发展相关的因子及预测肿瘤复发的生物学标志物是近年来研究的热点。趋化因子能够通过受体间的特异性结合促进肿瘤细胞的增殖与转移，而趋化因子CXC配体13(CXCL13)主要分布于外周B细胞和T细胞亚型上，与肝细胞癌、胃癌、乳腺癌等多种恶性肿瘤的发生发展、侵袭浸润有一定相关性[2～4]。双重特异性酪氨酸磷酸化调节激酶1b(Dyrk1b)在细胞周期及细胞凋亡过程中发挥重要作用，可使细胞处于休眠状态而提高肿瘤生存力，在上皮性卵巢癌等多种恶性肿瘤组织中呈过表达[5,6]。本研究观察宫颈癌组织中CXCL13、Dyrk1b蛋白的表达变化，并探讨二者与患者临床病理参数及预后的关系。

1 资料与方法

1.1 临床资料 收集2015年5月～2017年12月本院收治的宫颈癌患者77例，均行宫颈癌根治术，术中切取癌组织及癌旁正常宫颈组织(距离肿瘤边缘1～2 cm)，术后经病理检查确诊。患者年龄38～69(47.56±7.36)岁。纳入标准：①术前均未接受化疗、放疗、内分泌治疗或免疫治疗；②临床分期参照2009年国际妇产科联盟(FIGO)分期标准[7]。排除标准：①术前有阴道用药等宫颈治疗史；②合并其他脏器恶性肿瘤；③妊娠；④组织伴严重出血坏死而影响免疫组化结果。本研究经医院伦理委员会批准，患者均签署知情同意书。

1.2 宫颈癌组织及癌旁正常组织中CXCL13、Dyrk1b蛋白表达检测 采用免疫组化法。组织标本经10%甲醛固定48 h，常规石蜡包埋，Leica石蜡切片机4 μm厚度连续切片，常规SP法免疫组化染色，实验步骤严格按照SP二步染色法试剂盒说明书进行。经室温脱蜡、水化后，柠檬酸盐缓冲液高压加热进行热抗原修复。一抗抗体采用鼠抗人CXCL13单克隆抗体(上海酶研生物科技有限公司)及兔抗人Dyrk1b(武汉博士德生物工程有限公司)单克隆抗体，CXCL13一抗的稀释浓度均为1∶50，Dyrk1b一抗的稀释浓度均为1∶100。置入4 ℃孵箱过夜，复温，二抗反应，DAB显色，苏木精复染细胞核，脱水，封片。已知阳性切片作为阳性对照，以磷盐酸缓冲液PBS代替一抗作为阴性对照。结果判定：组织切片于高倍镜下随机选定视野，镜下计数1 000个细胞，计算均值。染色程度评分：无染色为0分，轻度染色(浅黄色)为1分，中度染色(棕黄色)为2分，重度染色(棕褐色)为3分。阳性细胞百分比评分：阳性细胞百分比<5%为0分，5%～25%为1分，>25%～75%为2分，>75%为3分。将以上两项评分相加，分值≥4分为蛋白阳性表达[8]。

1.3 术后随访 77例宫颈癌患者均采用电话和门诊随访，随访截止至2018年9月30日，随访时间为9～40个月，中位随访时间33个月。以确诊时间为起点，以患者死亡、失访或最近一次随访时间生存为终点。

2 结果

2.1 宫颈癌组织及癌旁正常组织中CXCL13、Dyrk1b蛋白表达比较 宫颈癌组织及癌旁正常组织中CXCL13蛋白阳性表达率分别为63.64%(49/77)、0，Dyrk1b蛋白阳性表达率分别为在80.52%(62/77)、14.29%(11/77)，宫颈癌组织中CXCL13、Dyrk1b蛋白阳性表达率高于癌旁正常组织(P均<0.05)。

2.2 CXCL13、Dyrk1b蛋白阳性表达与患者临床病理参数的关系 CXCL13蛋白阳性表达与肿瘤直径、FIGO分期、淋巴结转移、浸润深度、组织分化程度有关(P均<0.05)，而与患者年龄、大体形态无关(P均>0.05)；Dyrk1b蛋白阳性表达与肿瘤直径、FIGO分期、淋巴结转移及浸润深度有关(P均<0.05)，而与患者年龄、组织分化程度、大体形态无关(P均>0.05)。见表1。

2.3 宫颈癌组织中CXCL13与Dyrk1b蛋白表达的相关性 经Spearman等级相关分析，宫颈癌组织中CXCL13与Dyrk1b蛋白表达呈正相关(r=0.361，P=0.023)。

2.4 CXCL13、Dyrk1b蛋白阳性表达与宫颈癌患者预后的关系 77例宫颈癌患者均成功随访，无失访病例，共12例患者在3年内死亡，3年生存率为84.42%(65/77)。CXCL13蛋白阳性表达患者49例，死亡11例，3年生存率为77.55%(38/49)；CXCL13蛋白阴性表达患者28例，死亡1例，3年生存率为96.42%(27/28)。二者3年生存率比较差异有统计学意义(P<0.05)。Dyrk1b蛋白阳性表达患者62例，死亡12例，3年生存率为80.64%(50/62)；Dyrk1b蛋白阴性表达患者15例，死亡0例，3年生存率为100.00%(15/15)。二者3年生存率比较差异有统计学意义(P<0.05)。

表1 CXCL13、Dyrk1b蛋白阳性表达与患者临床病理参数的关系[例(%)]

图1 CXCL13蛋白阳性与阴性患者生存曲线

3 讨论

宫颈癌是发生于宫颈、阴道或移行带鳞柱交界处的女性生殖系统恶性肿瘤[9]，其发病率位居女性生殖系统肿瘤的第一位，严重危害女性健康。随着宫颈癌筛查手段的普及，宫颈癌的早期诊断率得到提高，能够明显改善患者预后，但晚期宫颈癌术后复发及远处转移依然是影响患者远期生存率的重要因素。恶性肿瘤的发生发展及浸润转移是由各种信号传导、趋化因子、转录因子等途径共同实现，因此，寻找识别新型宫颈癌发展相关的因子及预测预后的标志物是近年来研究的热点。

图2 Dyrk1b蛋白阳性与阴性患者生存曲线

CXCL13是来自于趋化因子家族的细胞因子，对B细胞具有选择性趋化作用，又称B细胞趋化因子，其编码基因位于人染色体4q21，调控肿瘤细胞的生长、增殖，抑制肿瘤细胞凋亡，最终诱发恶性肿瘤的发生发展[10]。多项研究表明，CXCL13在肝癌、乳腺癌、胃癌组织中均呈高表达，且其表达率与患者术后生存率相关[11～13]。Xu等[12]研究发现，CXCL13抑制剂能够缩小肿瘤体积，降低CXCR5/ERK信号通路关键成员CXCL13、CXCR5和ERK的mRNA和蛋白表达。由此推测CXCL13抑制剂可能通过作用于CXCR5/ERK信号通路来减弱肿瘤组织的生长。本研究发现癌旁正常组织CXCL13蛋白阴性表达，且宫颈癌肿瘤越大、临床分期越高、浸润深度越深、组织分化越差及有淋巴结转移的患者CXCL13蛋白阳性表达率越高，且CXCL13阳性患者累积生存率低于阴性患者，与Chen等[14]研究相符。可见CXCL13在宫颈癌的恶性进展过程中发挥重要作用，其高表达提示预后不良，这可能与CXCL13促进肿瘤新生血管的生成及肿瘤细胞的增殖活化、转移有关。

Dyrk1b是双特异性酪氨酸磷酸化调节激酶的成员，是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，位于人19号染色体，具有稳定蛋白结构、促进细胞增殖等作用，在多种恶性肿瘤中均呈过度表达，Dyrk1b通过稳定cyclin依赖性激酶抑制剂p27Kip1和诱导cyclin D降解来使细胞处于静止期[15]。Lin等[16]研究发现，Dyrk1b在宫颈癌组织及细胞中均呈过表达，其表达随着宫颈病变进展而增加。AZ191作为Dyrk1b的抑制剂，可诱导细胞凋亡，抑制宫颈癌细胞的增殖及侵袭。且研究表明，Dyrk1b基因敲除后能够通过改变调控肿瘤细胞增殖分化相关蛋白bcl-2的结构和化学性质，抑制肿瘤细胞分化、诱导细胞凋亡[17]。本研究结果显示，Dyrk1b高表达于宫颈癌组织，且宫颈癌肿瘤越大、临床分期越高、浸润深度越深及淋巴结转移的患者组织中Dyrk1b蛋白阳性表达率越高，与相关研究[18]结果相符。Chen等[19]研究显示，Dyrk1B通过磷酸化FoxO1参与乳腺癌的进展，Dyrk1B在乳腺癌组织和细胞中过表达，且其表达与肿瘤大小、分级等有关，Dyrk1b高表达预示患者预后较差。本研究中Dyrk1b阳性表达患者累积生存率低于阴性表达患者，可见Dyrk1b与宫颈癌的恶性进展及预后均密切相关。此外，本研究发现宫颈癌组织中CXCL13与Dyrk1b的表达呈正相关，提示二者之间可能存在某种直接或间接作用关系，有待进一步深入探讨其中的机制。

综上所述，CXCL13、Dyrk1b蛋白在宫颈癌组织中呈高表达，二者均在宫颈癌的发生发展、转移及浸润方面发挥重要作用，且CXCL13与Dyrk1b的表达呈正相关。CXCL13与Dyrk1b的作用机制仍需多中心、大样本的研究深入讨论，二者有望作为预测预后的指标或作为潜在的治疗靶点。