共生菌对荷瘤小鼠肺泡巨噬细胞基因表达的调控作用

程民，毛菊，杨雯雯，吴新春，陈稳，徐婷娟，沈国栋，胡世莲

[中国科学技术大学附属第一医院(安徽省立医院)，安徽省老年医学研究所，肿瘤免疫与营养治疗安徽省重点实验室,合肥 230001]

共生菌群被喻为呼吸道健康的“看门人(gatekeeper)”，在器官发育和免疫稳态维持中发挥重要作用，肠道共生菌与肺脏关系密切，在机体内形成“肠-肺”轴，远端调控肺脏免疫稳态[1]。肺泡巨噬细胞是肺脏内最为丰富的固有免疫细胞，在启动及调控肺脏免疫应答中发挥重要作用[2]。共生菌在肺泡巨噬细胞免疫稳态维持及抗肿瘤免疫应答中发挥着非常重要的调控作用[3-4]，共生菌对肺泡巨噬细胞免疫应答能力调控的分子机制是值得深入研究的科学问题。本研究通过筛选共生菌缺失荷瘤小鼠与正常荷瘤小鼠肺泡巨噬细胞中差异表达的基因并进行生物信息学分析，进而探讨共生菌群对荷瘤小鼠肺泡巨噬细胞基因表达的调控作用。

1 材料与方法

1.1 材料 实验动物： C57BL/6小鼠(5～6周龄，雌性，SPF级)购自上海斯莱克实验动物责任有限公司，22 ℃，55%湿度，12小时昼/夜节奏，所有实验操作过程均遵循实验动物管理规范条例执行。

抗菌药物： 氨苄青霉素、新霉素、万古霉素和甲硝唑等购自生工生物工程(上海)股份有限公司。

细胞株及培养试剂： LLC细胞购自美国典型培养物保藏中心，DMEM液体培养基、胎牛血清、胰蛋白酶溶液及青霉素-链霉素溶液(100×)等购自HyClone公司。

流式抗体及细胞分离试剂等：anti-mouse F4/80(FITC)、anti-mouse CD11c(PE)、anti-mouse CD11b (PerCP-Cy5.5)抗体及同种型抗体购自BD公司，大鼠血清购自Reanta公司，PBS磷酸盐缓冲液(干粉)购自北京索莱宝科技有限公司，Percoll溶液购自GE Healthcare公司，胶原酶I购自Sigma公司，Trizol试剂购自Invitrogene公司。

1.2 方法 构建共生菌缺失小鼠： 使用含有组合抗菌药物的饮用水连续饲喂C57BL/6小鼠(5～6周龄，雌性，SPF级)4～6周，建立共生菌缺失小鼠模型。组合抗菌药物水的配方为含1 g/L氨苄青霉素、1 g/L甲硝唑、1 g/L硫酸新霉素和0.5 g/L万古霉素4种抗菌药物的饮用水。饲喂期间观测小鼠体质量变化、活动状态等，对体质量降低严重(下降30%以上)的小鼠进行安乐死，健康对照组小鼠使用不含抗菌药物的饮用水进行饲喂。

荷Lewis肺癌小鼠模型的构建： 利用共生菌缺失小鼠(抗菌药物水饲喂5周)及正常对照小鼠(C57BL/6鼠，雌性，10 周龄，SPF级)，尾静脉注射LLC细胞(2×106个/鼠，250 μL PBS)，建立荷Lewis肺癌小鼠模型[3]。

肺泡巨噬细胞的分离纯化： 荷瘤21 d后，取共生菌缺失荷瘤小鼠及正常荷瘤小鼠各30只，每组分为2个样品，15只小鼠/样品，摘眼球放血后，脱臼处死，摘取肺脏，去除残余血管后，将肺脏组织剪碎至直径小于1 mm，使用DMEM 培养基(含0.1%胶原酶I，5%新生牛血清，100 u/mL青霉素，100 μg/mL 链霉素)重悬，之后37 ℃，200 r/min，消化1 h，将消化液通过200目的不锈钢筛网，4 ℃，1 260 g，离心20 min，弃上清。将沉淀用40%的Percoll溶液重悬，轻加于70%的Percoll溶液上，25 ℃，1 260 g(升速1，降速0)，离心30 min，收集40%和70% Percoll溶液界面处的细胞，1×PBS溶液洗2遍(25 ℃，2 400 r/min，10 min)，大鼠血清封闭后，标记荧光抗体，使用流式细胞术分选，得到表型为F4/80+CD11c+的肺泡巨噬细胞。

基因芯片检测： 将1.2.3中得到的肺泡巨噬细胞转移至1.5 mL 无菌Ep管中，1×106个/管，1 260 g，4 ℃，离心10 min，弃上清，每管加入0.5 mL Trizol试剂溶解细胞，使用miRNeasy Mini Kit(货号217004，Qiagene公司)进行RNA抽提，抽提所得总RNA经Agilent Bioanalyzer 2100电泳质检合格后，交由上海伯豪生物技术有限公司完成表达谱基因芯片检测，所用芯片为SBC-lncRNA(小鼠4×180k)芯片，具体操作按试剂盒说明书进行。

基因芯片结果分析： 完成杂交的芯片使用Agilent Microarray Scanner进行扫描，软件设置为Dye channel:Green,Scan resolution=3 μm,PMT 100%,20 bit。用Feature Extraction software 10.7读取数据，GeneSpring Software 11.0进行归一化处理，利用变化倍数及t检验方法筛选差异基因，筛选条件为变化倍数≥2，P<0.05。基因分类(GO)、KEGG通路分析按照文献[5-6]方法进行。

1.3 统计学处理 采用SPSS 17.0软件进行数据分析，使用Origin 7.5软件绘图并解析。观测数据均为计量资料，以mean±SEM表示，使用两独立样本t检验比较各组样本间的差异。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 共生菌缺失荷瘤小鼠与正常荷瘤小鼠肺泡巨噬细胞之间存在差异性表达的基因 利用流式细胞术对共生菌缺失荷瘤小鼠及正常荷瘤小鼠肺泡巨噬细胞进行分选，分选后的肺泡巨噬细胞(F4/80+CD11c+)纯度在98%以上(图1A)，利用基因芯片技术检测上述纯化后肺泡巨噬细胞的基因mRNA表达情况并筛选差异表达基因，结果表明，共生菌缺失荷瘤小鼠与正常荷瘤小鼠肺泡巨噬细胞之间差异倍数≥2的基因共有353个，其中上调基因171个(占48.4%)，下调基因182个(占51.6%)，如图1B和图1C所示。

2.2 共生菌缺失荷瘤小鼠肺泡巨噬细胞差异性表达基因的功能分析 对共生菌缺失荷瘤小鼠肺泡巨噬细胞差异性表达基因(变化倍数≥2)进行了GO及KEGG通路等分析。GO分析的结果表明，共生菌缺失后荷瘤小鼠肺泡巨噬细胞差异表达的基因GO分类主要为细胞凋亡、趋化作用、血管生成、分泌、细胞分化、细胞增殖、对刺激的反应性、运动、信号、多器官过程及免疫系统过程等(图2A、图2B)。KEGG通路分析结果表明，共生菌缺失后荷瘤小鼠肺泡巨噬细胞差异性表达基因主要与氮素代谢、趋化因子信号通路、TGF-β信号通路、肿瘤通路、细胞因子-细胞因子受体相互作用等信号通路密切相关(图2C)。

注：WT+LLC为共生菌正常的荷瘤小鼠；Abx+LLC为共生菌缺失的荷瘤小鼠

图1共生菌缺失对荷瘤小鼠肺泡巨噬细胞基因表达的影响

图2 共生菌缺失荷瘤小鼠肺泡巨噬细胞差异表达基因的功能分析

2.3 共生菌缺失荷瘤小鼠肺泡巨噬细胞中M1/M2型巨噬细胞特异性基因的表达情况 对共生菌缺失荷瘤小鼠及正常荷瘤小鼠肺泡巨噬细胞中M1和M2型巨噬细胞特异性基因表达情况进行了分析，结果显示，共生菌缺失荷瘤小鼠肺泡巨噬细胞中M2型巨噬细胞特异性基因CCL24、Arg1、Retnla及IL-13等表达上调(变化倍数≥2)，M1型巨噬细胞特异性基因CCL8表达上调(变化倍数≥2)，IL-12A基因表达下调(变化倍数≥2)。见图3。

3 讨论

呼吸道是一个复杂的黏膜组织，从鼻腔到肺泡(上呼吸道和下呼吸道)均有特定的共生菌群，在维持肺脏健康以及在呼吸系统疾病发生发展中具有重要作用[7]，肠道共生菌亦可远端调控肺脏免疫稳态及免疫应答。肺脏内的巨噬细胞按照其所在位置分为肺泡巨噬细胞、间质内巨噬细胞及游离在肺脏血管内的巨噬细胞[8]，肺泡巨噬细胞具有F4/80+CD11c+巨噬细胞表型，是肺泡腔表面分布最为丰富的固有免疫细胞，作为机体抵御病原体和污染源的第一道防线，启动及调控肺脏的免疫应答[2]。肺泡巨噬细胞较肺脏间质内巨噬细胞具有更强的清除微生物感染的能力，能够产生高水平的活性氧中间体(ROI)、NO、TNF-α和细胞毒性，参与多种肺脏疾病的发生发展。共生菌对肺泡巨噬细胞的表型及功能具有重要作用，呼吸道共生菌信号调控肺泡巨噬细胞的功能和极化状态[4,9]，肠道共生菌信号对肺泡巨噬细胞的功能亦具有重要的调控作用[10-12]，已有研究证实肠道共生菌来源的信号是建立巨噬细胞活化阈值所必不可少的免疫刺激[13]。在外部环境信号刺激下，巨噬细胞发生M1或M2型极化，M1型巨噬细胞发挥细胞毒活性和抗肿瘤活性，M2型巨噬细胞发挥免疫调节功能、促进Th2细胞活化、参与组织修复等。

本课题组前期的研究发现，共生菌缺失小鼠较正常小鼠更易发生肺部肿瘤(黑色素瘤及Leiws肺癌)，并且明确了共生菌缺失小鼠接种黑色素瘤后肺泡巨噬细胞基因表达的变化情况，但共生菌缺失对接种Leiws肺癌小鼠肺泡巨噬细胞基因表达的影响尚不明确[2,4]。本研究利用流式细胞术分选共生菌缺失荷Leiws肺癌小鼠及正常荷Leiws肺癌小鼠肺泡巨噬细胞，利用基因芯片技术筛选差异表达基因，并对差异表达基因进行生物信息学分析，结果表明，共生菌缺失荷瘤小鼠与正常荷瘤小鼠肺泡巨噬细胞之间存在353个差异表达的基因(差异倍数≥2)，上调基因171个(占48.4%)，下调基因182个(占51.6%)；M2型巨噬细胞特异性基因CCL24、Arg1、Retnla及IL-13等在共生菌缺失荷瘤小鼠肺泡巨噬细胞中表达上调(变化倍数≥2)，M1型巨噬细胞特异性基因CCL8表达上调、IL-12A基因表达下调(变化倍数≥2)。生物信息学分析结果表明，差异表达基因GO分类主要集中在细胞凋亡、趋化作用、血管生成、分泌、细胞分化、细胞增殖、对刺激的反应性、运动、信号及免疫系统过程等方面。同时，差异表达基因与氮素代谢、趋化因子信号、TGF-β信号、肿瘤、细胞因子-细胞因子受体相互作用等KEGG通路密切相关。

注：WT+LLC为共生菌正常的荷瘤小鼠；Abx+LLC为共生菌缺失的荷瘤小鼠

本研究发现共生菌可以调控荷瘤小鼠肺泡巨噬细胞中基因的表达水平，共生菌缺失导致M2型巨噬细胞特异性基因CCL24、Arg1、Retnla及IL-13等表达上调。共生菌缺失导致的差异性表达基因与细胞凋亡、趋化、血管生成、分泌、分化、增殖等GO分类及趋化因子、肿瘤等KEGG通路密切相关，上述结果为深入探讨共生菌在肺泡巨噬细胞免疫稳态维持及抗肿瘤免疫应答中的作用及机制提供了重要依据和参考。