高效液相色谱法测定替考拉宁血药浓度及其在重症感染患者中的应用

晨迪，杨昭毅，沈爱宗，张圣雨，苏丹，宁丽娟，杨本军

[1.安徽中医药大学药学院，合肥 230031；2.中国科学技术大学附属第一医院(安徽省立医院)药剂科]

替考拉宁属于糖肽类抗菌药物，可用于治疗各种严重的革兰阳性菌感染，包括不能用青霉素类及头孢菌素类抗生素治疗或用上述抗生素治疗失败的严重葡萄球菌感染，或对其他抗生素耐药的葡萄球菌感染。替考拉宁于2000年12月进入国内，因其抗菌作用强、肾毒性低等优势，临床应用日益增多，特别是肾功能不全的老年严重感染患者。但由于其口服不吸收，静脉使用时血浆蛋白结合率达90%以上等特性，在特殊人群使用时，体内血药浓度会发生显著变化[1-3]。因此本研究以建立替考拉宁血药浓度监测方法为基础，分析替考拉宁血药浓度结果，为临床合理使用药品，进行个体化用药提供依据。

1 仪器和材料

1.1 仪器 色谱仪：安捷伦1200；检测器：二极管阵列检测器，型号：G1365A；色谱柱：Agilent C18 色谱柱，250 mm×4.6 mm，5 μm；离心机：SIGMA，型号：D37520；旋涡混合器：IKA，型号：V2；pH计：梅特勒—托利多，型号：FE20；万分之一分析天平：德国Sartorius，型号：CP225D；超纯水机：Heal Force，型号：SMART-N。

1.2 材料 替考拉宁标准品：100 mg，中国食品药品检定研究院，批号：130374-201002；哌拉西林钠标准品：TCI公司，批号：5C8OB-SH；乙腈：天津福晨化学试剂有限公司(20141022)；二氯甲烷:上海润捷化学试剂有限公司(20170401)；水：自制超纯水。

2 方法

2.1 标准品溶液和内标溶液的制备

2.1.1 标准品溶液 精密称取替考拉宁标准品19.93 mg于10 mL容量瓶中，加入超纯水溶解稀释至刻度，充分混匀。得1.993 mg/mL的对照品储备液。放置于冰箱中冷藏保存，备用。

2.1.2 内标溶液 精密称取哌拉西林钠标准品15.03 mg于100 mL容量瓶中，加入超纯水溶解稀释至刻度，充分混匀。得0.15 mg/mL的对照品储备液，放置于冰箱中冷藏保存，备用。

2.2 血浆样品处理 血浆样品处理办法：精密量取400 μL血浆样本，加入内标哌拉西林钠工作溶液(0.15 mg/mL)50 μL，加入600 μL乙腈。震荡涡旋1 min，12 000 r/min离心5 min，取上清液900 μL于离心管中，加入400 μL二氯甲烷，震荡涡旋1 min，于12 000 r/min离心5 min，取上清液于样品瓶中，20 μL进行分析。

2.3 实验条件建立

2.3.1 色谱条件 流动相：0.01 mol/L NaH2PO4(磷酸调pH至3.3)-乙腈(72:28)；柱温：35°；检测波长:240 nm；流速：1.0 mL/min；进样量：20 μL。

2.3.2 专属性考察 取空白血浆、对照品加空白血浆、患者血样，血浆样品后，进样检测。

2.3.3 标准曲线绘制 精密吸取标准品替考拉宁储备溶液50 μL，加入空白血浆950 μL，配制成替考拉宁浓度为99.650 μg/mL(A)，49.825 μg/mL(B)，24.913 μg/mL(C)，12.456 μg/mL(D)，6.228 μg/mL(E)，3.114 μg/mL(F)的样品。处理血浆样品后进样检测。

2.3.4 精密度准确度试验 配制替考拉宁浓度为33.22 μg/mL(H)，11.07 μg/mL(M)，3.69 μg/mL(L)，3.114 μg/mL(F)的质控系列血样。分别取替考拉宁质控浓度的400 μL血浆样本溶液及哌拉西林钠工作溶液(0.15 mg/mL)50 μL，配制成替考拉宁质量控制(QC)样品，连续测定3 d，计算QC样品的测得浓度，计算批内和批间的精密度准确度。

2.3.5 定量下限评价 标准曲线样品F(3.114 μg/mL)，处理血浆样品后进样检测，观察信噪比(S/N)是否大于10。

2.4 重症患者血药浓度监测

2.4.1 纳入标准 (1)治疗性使用替考拉宁的成年患者；(2)感染性疾病包括以下情况之一：呼吸道感染、血流感染、导管相关感染、感染性心内膜炎、中性粒细胞减少伴发热、骨和关节感染、腹腔感染、皮肤和软组织感染。

2.4.2 排除标准 出现以下任意一项情况的患者应排除：(1)非静脉使用替考拉宁的患者；(2)预防性使用替考拉宁的患者；(3)使用替考拉宁后24 h内死亡的患者；(4)对本品过敏或存在其他不适合使用本品的情况；(5)主动要求退出的患者。

2.4.3 给药方案 注射用替考拉宁(赛诺菲-万安特公司生产)，成人剂量每次6 mg/kg或400 mg，持续滴注，前3剂，每12小时给药1次，此后每24小时给药1次。严重烧伤或感染性心内膜炎患者维持剂量可能需要达到12 mg/kg。肾功能不全患者按照说明书调整用药剂量。

2.4.4 采血方案 准确记录用药时间及采血时间(血样采集时间点为第1 剂给药后24 h和第6剂给药前30 min)；抽取静脉血1～2 mL，置于含EDTA的抗凝管中；静止30 min，4000 r/min离心10 min，分离出血浆，待测。

2.5 统计学处理 采用SPSS 25.0统计软件对收集的数据进行线性回归分析，和数据概括性度量。α=0.05。

3 结果

3.1 方法学评价

3.1.1 专属性考察 测得色谱图结果如图1～3所示。空白血清中未见干扰峰，替考拉宁各组分分离且峰形较好。

3.1.2 标准曲线绘制 以替考拉宁(TA2-2)峰面积(A替考拉宁)与内标峰面积(A内标)的比值作为Y 对替考拉宁总浓度X作线性回归分析，采用加权最小二乘法，获得回归方程标准曲线：Y=0.03X+0.004，r=0.9998，线性范围是3.114～99.650 μg/mL，结果见图4。

图1 空白血浆色谱图

图2 标准血浆样品色谱图(加入内标溶液)

图3 患者血浆样品色谱图(加入内标溶液)

图4 标准曲线图：以替考拉宁(TA2-2)峰面积(A替考拉宁)与内标峰面积(A内标)的比值作为Y对替考拉宁总浓度X作线性回归分析

3.1.3 精密度准确度试验 血浆样品测定3 d，计算QC样品的测得浓度，计算批内和批间的精密度准确度，结果见表1和表2。测得替考拉宁最低定量限、低、中、高4个浓度的质控样品批内、批间精密度RSD均小于15%；准确度均在98.26%～111.54%之间。

表1 替考拉宁的精密度结果 (n=5,%)

表2 替考拉宁的批内批间准确度结果(n=5,%)

3.1.4 定量下限试验 按相关要求进行试验，定量下限(F)为3.114 μg/mL的血浆样品经检测后，信噪比(S/N)显示为17.3。

3.2 血药浓度监测结果 本研究纳入23例患者，测定替考拉宁血药浓度46次。23例患者中血液科有16例，ICU有4例，急诊内科有3例。女性12例，男性11例。年龄范围20～83岁，年龄(51.91±19.39)岁。分别对第1 剂给药后24 h和第6 剂给药前30 min的谷浓度进行测定。

结果表明，第1次采血点替考拉宁谷浓度范围为3.91～35.92 mg/L，不符合正态分布(P=0.032<0.05)，故使用中位值和上下四分位法描述：10.86(7.02,15.66)mg/L，变异系数62.99%。第2次采血点替考拉宁谷浓度范围为1.5～81.7 mg/L，不符合正态分布(P=0.001<0.05)，故使用中位值和上下四分位法描述：9.33(7.30,；21.18)mg/L，变异系数100.41%。2次采血替考拉宁谷浓度均高于10 mg/L的仅9例，仅占总人数的39.13%(我国推荐的有效浓度范围为≥10 mg/L)结果见表3。再对46例次患者浓度进一步分析，结果见表4。

表3 23例患者血药浓度监测一览表

表4 替考拉宁血药浓度分布情况[例(%)]

4 讨论

4.1 血药浓度方法学确定 替考拉宁是由5个结构相似的化合物组成，其中TA2-2占主要成分，且大多数文献选用并证实仅测量TA2-2与测量5个成分差异无统计学意义[4]。故本研究通过检测TA2-2的浓度以代替替考拉宁的浓度。高效液相色谱法，作为测定血药浓度的常用检验方法具有专属性强、精密度高，成本低等特点而被广泛应用。虽然HPLC测定替考拉宁血药浓度，国内外均有报道，但本研究所选取的流动相和色谱条件与先前报道相比稍有不同。

与单一的乙腈沉淀蛋白相比，增加二氯甲烷萃取步骤可纯化样品，有效避免内源性物质的影响。本试验的关键点在于血浆样本的采集。替考拉宁作为时间依赖性抗菌药物，治疗效果和谷浓度密切相关。实际研究中监测的浓度为谷浓度，因此确切的采集时间点是确定采集的血药浓度是否为谷浓度的保证，也是保证试验应用结果的关键点。

在实际操作中仍发现有不足。第一，此方法在内标的选取上是哌拉西林钠，但哌拉西林钠属于ICU经常使用的联合治疗药物，当监测到联用哌拉西林钠的患者时，哌拉西林钠峰会异常，此时无法使用内标法检测需改用外标法。第二，本实验选用乙腈—磷酸盐为流动相，色谱柱易堵塞，样品分析后需要长时间清洗。以上是后期实验将要注意与改进的地方。

4.2 推荐给药剂量下血药浓度达标情况 替考拉宁作为游动放线菌发酵后提取的糖肽类抗生素，相较于万古霉素，替考拉宁具有肾毒性低、耐药性低、更易透入组织和细胞等特点受到医生关注[5]。大部分关于替考拉宁血药浓度的研究认为：替考拉林血药浓度<10 mg/L表示未达到治疗所需浓度；浓度在10～<20 mg/L对危重患者抗革兰阳性菌的感染有疗效；应对难治的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌研究显示替考拉宁谷浓度需达到≥20 mg/L；当浓度≥60 mg/L时即产生毒性的血药浓度[6-9]。

本研究中的患者均给予推荐的剂量，精确的血样采集时间。以10 mg/L为谷浓度的标准，发现替考拉宁血药浓度达标率低。两次采血点的达标率为56.52%和47.83%，变异系数大。过低的谷浓度会诱发细菌耐药，控制感染不佳，延长患者住院时间[10]。过高的血药浓度也会产生毒性效应，本研究中也有超过毒性血药浓度的例次出现。

本研究还存在一些局限性。第一，本研究纳入人数较少，仅23例，46例次检验结果；第二，仅对浓度进行评价。未关注与血药浓度相关的肌酐清除率等指标及临床效果和不良反应的发生。下一步研究可关注患者的肌酐清除率或白蛋白[11]等检测指标与替考拉宁血药浓度之间的关系，并做分层临床研究。

综上所述，本研究建立了替考拉宁血药浓度灵敏、准确度高的测定方法，可用于对重症患者的血药浓度监测。由于患者的病理变化，对药代动力学的改变，使得同样的药物及给药方案会在患者身上出现差异较大的结果的现象发生。因此，需要具有抗感染专业知识的药学专业技术人员根据患者其他信息并结合血药浓度测定的结果，给出调整药物治疗方案(调整剂量或者更换药物)的建议。指导合理使用药物不仅可以在治疗开始时就给予有效且安全的剂量，还可以维持治疗浓度，提高治疗效果，缩短治疗时间，减少不良反应的发生，达到“个体化给药”的目的。