拓展等效线图法评估离子液体与杀菌剂多果定之间的拮抗作用

张瑾，姜慧，董欣琦，卞志强

1. 安徽建筑大学环境与能源工程学院，安徽省水污染控制与废水资源化重点实验室，合肥 230601 2. 清华大学新兴有机污染物控制北京市重点实验室，北京 100084

化学品污染已引起了严重的环境问题。混合物是污染物在环境中存在的普遍规律，混合物产生的累积毒性与相互作用对环境中暴露的生物具有潜在的风险。因而，化学混合污染物毒性评估与预测是环境化学领域研究的热点[1-2]。等效线图法是一种经典的二元混合物联合毒性作用的图形分析方法，可以直观地反映观测值是否偏离预测模型[3-5]。但经典等效线图法只能分析化学混合物在某个特殊效应水平下(通常为半数效应浓度EC50)的相互作用[6-7]，如王成林等[8]应用等效线图法分析3种咪唑类离子液体和杀菌剂甲霜灵(MET)在半数效应浓度(EC50)水平时的毒性相互作用，发现二元混合物体系的相互作用(协同作用或拮抗作用)随MET浓度比的变化而变化。

然而，在实际的环境体系中，大多数毒物及其混合物的浓度往往远低于50%效应的浓度[9]。因此，经典等效线图法在实际应用中受到了限制，需要将等效线图法进行拓展，以适于包括高、低效应水平在内的多个效应水平下的混合物毒性相互作用评估。Zhang等[10]在评估离子液体和农药间相互作用研究中，将等效线图法进行了拓展，并应用于评估多个效应水平下预测混合毒物的相互作用，结果发现混合物在多个效应水平下表现出不同的作用类型。

离子液体(ionic liquids, ILs)是一种所谓的“绿色”有机溶剂[11]，根据其结构可分为咪唑类和吡啶类ILs。近年来，因其具有在常温下蒸气压低、不易燃等优良特性，尤其是不挥发的特性，减少了对空气的污染，因而被广泛应用于合成、催化和提取等化工领域中[12-15]。然而，正是其广泛的应用和很高的水溶性，进入环境后，ILs很可能会对水体中生物的生存构成很大的威胁[16]。同时，污染物并不仅仅以其自身原本的形式和浓度存在，在进入环境中后，会与其他污染物如农药等结合成各种形式和浓度的混合污染物，进而对环境中的生物甚至人类的生存和健康构成更大的风险[17-18]。目前已有大量文献报道ILs尤其是咪唑类ILs与其他污染物共存时对水生生物产生很强的联合毒性，而关于吡啶类ILs的研究报道较少。

因此，本文基于吡啶环上烷基链的分子结构设计特点，以3种具有不同烷基链长的溴代吡啶离子液体：溴化丁基吡啶([bpy]Br)、溴化己基吡啶([hpy]Br)、溴化辛基吡啶([opy]Br)和杀菌剂多果定(Dod)为研究对象，应用直接均分射线法设计离子液体与农药多果定的二元混合物体系，并应用拓展等效线图法分析在5个不同的效应水平(ECx)下的混合物体系的毒性相互作用情况，与经典等效线图法和浓度加和(concentration addition, CA)模型评估的结果进行比较，研究结果将为化学混合物毒性相互作用评估提供方法和数据参考。

1 材料与方法(Materials and methods)

1.1 实验仪器与材料

BioRad酶标仪(美国Bio-Rad公司)、MGC-250型智能型光照培养箱(上海一恒科技有限公司)、BT25S型五位电子天平(赛多利斯科学仪器(北京)有限公司)、70SW-CJ-IF超净工作台(苏州佳宝净化工程设备有限公司)、Dragon-lab单道可调移液器(10～100 μL)、手动12道移液器(大龙兴创实验仪器有限公司)(50～300 μL)和Milli-Q超纯水系统(美国Millipore公司)。

[bpy]Br、[hpy]Br和[opy]Br购自德国Merck公司，多果定(Dod)购自德国Dr Ehrenstorfer GmbH公司，4种试剂均为优级纯试剂，其结构式见图1，其CAS登记号、分子式和分子量等参数见表1。实验前均用Milli-Q超纯水配制储备液并保存在棕色瓶中，置于4C冰箱保存待用。

图1 4种化学物质的结构式注：Dod表示多果定，[bpy]Br、[hpy]Br和[opy]Br表示 溴化丁基吡啶、溴化己基吡啶和溴化辛基吡啶。Fig. 1 The structures of four chemicals Note: Dod stands for dodine; [bpy]Br, [hpy]Br and [opy]Br stand for bromide butyl pyrimidine, bromide hexyl pyrimidine and bromide oxyl pyrimidine.

1.2 菌种的培养和毒性测试

青海弧菌(Vibrioqinhaiensissp.-Q67, Q67)购自北京滨松光子技术股份有限公司，液体培养基配方及菌种培养方法参见文献[19]，Q67活化和接种方法见文献[20]。

采用微板毒性分析法(microplate toxicity analysis, MTA)测定每个化学毒物以及它们的混合物体系对Q67的发光抑制毒性[21-22]。每个组分及其混合物射线均设计12个浓度梯度、3个平行，同时设24个空白对照，并重复3板。每孔试液总体积200 μL，其中菌液100 μL。在酶标仪上测定各试液的相对发光单位(RLU)，依据空白RLU的平均值(I0)和各浓度梯度3次测量RLU的平均值(I)，计算出毒物及其混合物体系各浓度梯度的发光抑制率E：

(1)

1.3 二元混合物设计

为了合理地探索整个浓度空间范围下二元混合物的毒性变化规律，采用直线均分射线法(direct equipartition ray design, EquRay)[23]设计3个ILs与农药Dod的3组二元混合物体系(Dod-[bpy]Br、Dod-[hpy]Br、Dod-[opy]Br)，每组混合物体系安排5条射线(R1、R2、R3、R4和R5)。每条射线代表具有一定浓度配比(pi,i=Dod、ILs)的二元混合物射线，实验中每条射线安排12个浓度点。EquRay设计的3组二元混合物体系的构成及其浓度配比见表2。

1.4 浓度效应拟合

应用MTA法获得的离子液体和多果定以及它们的二元混合物体系对Q67的浓度-效应数据，采用Weibull和Logit函数进行最小二乘拟合，Weibull和Logit如式(2)和(3)所示：

E=1/(1+exp(-α-βlog10(c)))

(2)

E=1-exp(-exp(α+βlog10(c)))

(3)

式中α和β分别为位置参数和斜率参数，c为毒物浓度。

表1 3种离子液体和农药多果定的基本性质、拟合函数及其统计量、半数效应浓度及其负对数Table 1 Physicochemical properties, fitted functions together with some statistics, the median effective concentration as well as their negative logrithm of three ionic liquids (ILs) and pesticide dozine

注：α和β是拟合参数，r和RMSE分别表示相关系数和均方根误差。

Note:αandβare two parameters;rand RMSE stand for correlation coefficient and root-mean square error, respectively.

1.5 浓度加和模型

选择标准加和模型CA为参考模型，比较观测毒性与CA模型预测毒性的大小：如果观测毒性大于、等于或小于CA模型预测毒性，则认为混合物发生了协同作用、加和作用或拮抗作用。CA模型公式表达为[24-25]：

(4)

式中：ci表示混合物效应为x时该混合物中第i个组分的浓度；ECx,i为第i个组分的等效应浓度；n是混合物中组分数。

1.6 等效线图法与拓展等效线图法

等效线图法[26-27]是用来评估二元混合物相互作用的图形分析法，在平面直角坐标系内展现二元混合物在某个特殊效应(50%)时混合物毒性相互作用情况。在传统的等效线图中，仅连接直角坐标系二元混合物组分EC50值点，构造截距，称为CA预测线。根据CA预测线位于观测值的置信区间内、上方或下方，表示二元混合物为加和效应还是非加和效应。如果CA预测线在观测值的置信区间内、上方或下方，则分别称混合物呈加和作用、拮抗作用或协同作用。拓展的等效线图法，不仅连接直角坐标系二元混合物组分EC50值点，同时连接多个ECx值点，实现了在多个效应水平下评估二元混合物的毒性相互作用。

2 结果与讨论(Results and discussion)

2.1 3种ILs和多果定对Q67的毒性

通过MTA法测得的3种溴代吡啶ILs和农药Dod在12 h对Q67的浓度-效应数据及Weibull函数和Logit函数拟合结果列于表1中，实验观测的浓度-效应数据及其拟合的浓度-效应曲线(CRCs)见图2。表1显示，Weibull函数和Logit函数都能较好地表征4种化合物的浓度-效应数据(r≥0.9971, RMSE≤0.036)。以半数效应浓度的负对数(-lgEC50即pEC50)作为毒性指标，4种毒物对Q67的毒性顺序为Dod>[opy]Br>[hpy]Br>[bpy]Br。Dod的毒性大于离子液体的毒性，同时3种离子液体对Q67的毒性都具有烷基链效应[28]，即其毒性随烷基链上碳原子数的增加而增加，则ILs的pEC50值几乎增加1，文献也报道了类似的结果[29-30]。从化学物的作用机制分析，多果定属于胍类杀菌剂，溶于水后会带正电荷，吸附于带负电荷的微生物表面，并渗透到微生物体内，聚合形成的薄膜堵塞微生物呼吸道通道，使微生物迅速窒息死亡[31]。发光菌Q67作为直接靶细菌，被多果定迅速锁定并杀死。这可能是多果定的毒性大于其他3种离子液体的原因。

图2 3种离子液体和多果定的浓度-效应曲线(CRCs)注：图中分散的点表示实验观测值，实线表示拟合线。Fig. 2 The concentration-response curves of three ionic liquids and dodine Note: The scattered points and solid lines in diagram represent the observed values and fitted lines, respectively.

图2显示4种化学物质对Q67的CRCs曲线呈经典的S形，相互之间几乎是平行的，表明4种化学物质对Q67的毒性响应随浓度变化的规律相似。

2.2 Dod-ILs混合物体系对Q67的毒性

3组多果定与ILs的二元混合物体系(Dod-[bpy]Br, Dod-[hpy]Br, Dod-[opy]Br)共15条射线对Q67的浓度-效应数据拟合结果见表2，拟合的15条射线的CRC曲线以及实验观测值绘于图3中。从表2中可看出Weibull函数和Logit函数能有效拟合3组多果定与ILs二元混合物的浓度-效应关系(r>0.9815, RMSE<0.068)。以pEC50作为毒性指标，结合表2中混合物组分的浓度配比pi值，可看出，随着混合物组分中pDod值的减小，3组二元混合物体系(R1～R5)的15条射线的pEC50值也随之逐渐降低，即各组二元混合物的毒性逐渐减小。且两者呈良好的线性关系，3组二元混合物体系的pEC50值与pDod的线性拟合关系方程如下：

Dod-[bpy]Br pEC50=111.21×pDod+2.2

(r=0.9774)

(5)

Dod-[hpy]Br pEC50=17.95×pDod+3.14

(r=0.9729)

(6)

Dod-[opy]Br pEC50=1.02×pDod+4.33

(r=0.7503)

(7)

表2 3组二元混合物的构成、组分浓度配比(pi)、拟合函数及其统计量、半数效应浓度及其负对数Table 2 The composites, concentration ratios (pi), fitted functions together with some statistics, the median effective concentration as well as their negative logrithm of three binary mixture rays

注：pDod和pILs表示多果定和离子液体的浓度比，L和W分别为Logit和Weibull。

Note:pDodandpILsstand for the concentration ratios of dodine and ionic liquids; L and W represent for Logit and Weibull, respectively.

从方程(5)～(7)可看出，混合物体系Dod-[bpy]Br和Dod-[hpy]Br的pEC50值与Dod的浓度比有很好的正相关性(r>0.97)，在混合物体系Dod-[opy]Br中，其pEC50值与Dod的浓度比的相关性稍差，可能是由于[opy]Br的毒性与Dod的毒性较接近的缘故[21,30,32]。

2.3 CA模型对Dod-ILs混合物体系的拮抗作用表征

CA模型能较好地评估大多数混合物的毒性[22,33-35]。本研究中，CA模型对于3组二元混合物体系中所有15条射线的毒性效应的评估预测结果也绘于图3中。从图3中可知，15条混合物射线的CA预测线均高于实验观测值，说明15条射线均为拮抗作用，但CA预测线偏离每条混合物射线的程度不同，即拮抗作用程度不同，这可能与混合物体系中各射线组分及其浓度配比的不同有关[36]，如Dod-[bpy]Br和Dod-[hpy]Br体系中射线的拮抗作用随组分浓度配比pDod的减少先逐渐增强然后逐渐减弱，而在Dod-[opy]Br体系中5条射线的拮抗作用随pDod的增加没有明显变化，可能是由于在Dod-[bpy]Br和Dod-[hpy]Br体系中，农药Dod的浓度配比pDod较小，而其毒性远大于2个ILs，而在Dod-[opy]Br体系中，2个组分的毒性较接近[37-39]。

2.4 等效线图法对Dod-ILs混合物体系的拮抗作用表征

图4是等效线图法对Dod-ILs混合物体系15条射线在50%浓度-效应水平时的毒性相互作用的表征结果。从图4中可知，15条射线的等效线图均位于CA预测线的上方，这说明在EC50效应水平下，混合物间均存在拮抗作用。

2.5 拓展等效线图法评价混合物毒性效应

图5是Dod与ILs的3组二元混合物体系在5个不同效应浓度(EC20、EC30、EC40、EC50和EC60)水平下的等效线图。从图5可知，3组混合物在5个效应水平线下的等效线均位于对应的CA预测线上方的拮抗区域，且不对称。同一混合物体系中，5条射线在同一浓度效应水平拮抗作用程度不同，在Dod-[hpy]Br体系中，R4的拮抗作用比其他4条射线的拮抗作用明显，而其他2个混合物体系的R4没有呈现出明显的变化。与图3相比，CA模型预测需要一个混合物体系的所有射线的CA线、观测值等必须逐一画出，比较麻烦，尤其是在同一个图内不容易展示，更不容易观察和比较相互作用情况。而拓展等效线图法不仅能表现出一组混合物体系中全部射线的相互作用类型，且能直观地分析比较出各射线毒性相互作用的变化情况，简化了混合物毒性相互作用比较分析的过程。与图4相比，拓展等效线图法不仅分析了EC50水平时毒性相互作用情况，也分析了其他效应水平，即拓宽了三组混合物体系拮抗作用评价的效应水平范围，且与浓度加和(CA)模型评估结果相似。因此，拓展后的等效线图法可以用于化学混合污染物实际环境的毒性评价。

图3 3组二元混合物体系的浓度-效应曲线及其浓度加和模型(CA)预测值注：●实验值；—拟合线；﹍CA预测线。Fig. 3 The concentration-response curves and predicted lines by concentration addition (CA) for three binary mixture systems Note: ● observed data; — fitted line; ﹍ predicted line by CA.

图4 3组二元混合物体系的等效线图注：圆圈及连接的线段为各射线等效点及95%观测置信区间；实曲线为拟合等效线；实直线为CA预测线。Fig. 4 Isobolograms for three binary mixture systems Note: circle and connected line segment represents equal toxicity point of each ray and 95% observation confidence interval; solid curve represents fitted equal toxicity line; solid line represents CA prediction line.

图5 3组二元混合物在5个不同效应水平的拓展等效线图注：R1、R2、R3、R4、R5为混合物混合射线；彩色实曲线为拟合等效线；彩色实直线为CA预测线。Fig. 5 Extended isobolograms at five effect concentration levels (EC20, EC30, EC40, EC50 and EC60) for three binary mixtures Note: R1, R2, R3, R4, R5 represents mixture ray; color solid curve represents fitted equal toxicity line; color solid line represents CA prediction line.

综上所述：(1)具有不同烷基链的3种吡啶类离子液体(ILS)对发光菌Q67的发光抑制毒性具有典型的烷基链效应，且4种毒物对Q67的毒性大小顺序为Dod>[opy]Br>[hpy]Br>[bpy]Br。

(2)3组二元混合物体系均呈明显的拮抗作用，且混合物射线毒性与Dod组分浓度具有一定的线性关系。

(3)拓展等效线图法能较好、直观地表征3组二元混合物体系的拮抗作用，与传统等效线图法相比，拓宽了评估混合物效应浓度水平的范围；与CA模型评估结果相似，不仅直观且简化了混合物毒性相互作用分析过程。