乙型肝炎病毒感染伴焦虑患者体内免疫应答研究*

尹家丽，杨海清

（云南省第三人民医院 检验科，云南 昆明 650000）

慢性乙型肝炎是临床常见的传染性疾病，除对肝脏造成损伤外，还可引起其他系统的疾病[1-2]。研究发现，慢性乙型肝炎病毒感染的患者发生心理疾病的概率较高，其中最突出的为焦虑症[3-4]。焦虑状态不仅直接影响患者配合治疗的态度，还可对机体免疫功能造成一定影响[5-6]。以往关于慢性乙型肝炎合并焦虑症患者机体免疫应答的研究较少，本研究旨在分析该类患者在抗病毒治疗过程中免疫功能的变化，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 研究对象

选取2015年1月—2017年1月云南省第三人民医院收治的慢性乙型肝炎患者90例。其中，男性48例，女性42 例；年龄30～72 岁，平均（55.8±5.1）岁；病程7～40年，平均（22.3±5.4）年；有症状52 例，无症状38 例。根据焦虑自评量表（self-rating anxiety scale,SAS）评分将其分为焦虑组（SAS 评分≥50 分）和对照组（SAS 评分＜50 分），每组45 例。另取同期参加体检的健康志愿者45 例作为空白组。纳入标准：①符合2010年版《慢性乙型肝炎防治指南》中关于慢性乙型肝炎的诊断标准[7]；②乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）DNA 阳性（HBV DNA ≥1×103copy/ml），乙型肝炎表面抗原阳性≥6 个月或既往有乙型肝炎表面抗原阳性史，目前仍为阳性[8]；③本研究前3 个月内未使用抗病毒药物、糖皮质激素等影响免疫功能的药物。排除标准：①合并其他病毒性肝炎、酒精性肝炎和药物性肝损伤患者；②合并肝细胞癌者；③合并自身免疫性疾病者；④合并严重高血压、糖尿病或重要器官功能不全者。研究经本院医学伦理委员会审批通过，所有研究患者知情并签署知情同意书。3组一般资料比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。见表1。

表1 3组一般资料的比较（n =45）

1.2 仪器与试剂

TGL16MB 高速离心机（长沙湘智离心机有限公司），HWS-20 恒温水浴箱（太仓市实验设备厂），艾森D2060R 流式细胞仪、流式试管及配套设备（艾森生物杭州有限公司），帝肯F50 型酶联免疫检测仪及白细胞介素-2（IL-2）、白细胞介素-4（IL-4）、白细胞介素-10（IL-10）、干扰素（Interfern,IFN）和肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor,TNF）检测试剂（瑞士Tecan 公司），淋巴细胞亚群试剂（艾森生物杭州有限公司），冷冻保存S180 艾氏腹水癌细胞（上海长征医院）。

1.3 方法

1.3.1 治疗方法 在一般保肝抗炎的基础上，给予阿德福韦酯片（福建广生堂药业股份有限公司，国药准字H20070198）10 mg，口服，1 次/d，胸腺肽注射液（云南南诏药业有限公司，国药准字H53021765）40 mg，静脉滴注，1 次/d，疗程均为1年。

1.3.2 血清细胞因子检测 治疗前及治疗12 周后取研究对象空腹静脉血15 ml，经抗凝、离心等处理后获得血清样本，通过酶联免疫吸附试验检测IL-2、IL-4、IL-10、IFN 及TNF 含量。

1.3.3 外周血淋巴细胞亚群检测 治疗前及治疗12 周后分别取流式试管3 支，编号1～3。向试管1 加入20 μl CD4-PE，向试管2 加入20 μl CD3-PC，向试管3 加入20 μl CD3-PC5/CD4-PE 双色试剂，后将抗凝全血加入上述试管，避光孵育25 min。取出试管，依次在其中加入400 μl 磷酸盐缓冲液（PBS）和红细胞裂解液OptiLyse C，震荡摇匀，避光孵育20 min。2 000 r/min 离心10 min 后将液体倒出，加入400 μl PBS 液震荡摇匀制备单细胞悬液。采用流式细胞仪检测单细胞悬液，通过软件分析并计算淋巴细胞中各标记细胞的比例[9]。

1.3.4 红细胞免疫指标检测 治疗前及治疗12 周后制备红细胞悬液和自身血浆各50 μl，加入100 μl细胞悬液充分混匀，在37℃温度下水浴20 min，加入0.25%戊二醛和生理盐水各100 μl。反应液均衡涂片，甲醇固定，烘干后加20 μl 瑞吉氏染液染色，采用郭峰法计算协同肿瘤红细胞花环率（associate tumor erythrocyte rosette rate,ATERR）、自然肿瘤红细胞 花环率（natural tumor erythrocyte rosette rate,NTERR）、红细胞C3b 受体花环率（red blood cell-C3b receptor rate 及红细胞免疫复合物花环率（red blood cellimmune complex rosette,RBC-ICR）[10]。

1.4 统计学方法

数据分析采用SPSS18.0 统计软件。计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验，治疗前后的比较采用配对t检验；计数资料采用例表示，比较用χ2检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3组血清细胞因子的比较

治疗前3组IL-2、IL-4、IL-10、IFN 及TNF 水平比较，差异有统计学意义（P＜0.05），各指标水平由高到低均依次为空白组、对照组和焦虑组。与治疗前比较，治疗12 周后焦虑组和对照组IL-2、IL-4、IL-10、IFN和TNF 水平均有所增加（P＜0.05）。治疗12 周后对照组各指标高于焦虑组（P＜0.05）。见表2。

2.2 3组外周血淋巴细胞亚群比例的比较

3组治疗前CD3+CD4+、CD8+、CD4+、CD4+/CD8+水平比较，差异有统计学意义（P＜0.05），CD3+CD4+、CD4+和CD4+/CD8+水平由高到低依次为空白组、对照组和焦虑组，CD8+由高到低依次为焦虑组、对照组和空白组（P＜0.05）。与治疗前比较，治疗12 周后焦虑组和对照组CD3+CD4+、CD4+和CD4+/CD8+有所升高，CD8+下降（P＜0.05）。治疗12 周后对照组CD3+CD4+、CD4+和CD4+/CD8+高于焦虑组，CD8+低于焦虑组见表3。细胞因子流式细胞结果分析见图1。

表2 3组血清细胞因子的比较（n =45，ng/L，±s）

表2 3组血清细胞因子的比较（n =45，ng/L，±s）

注：①与对照组比较，P ＜0.05；②与治疗前比较，P ＜0.05。

IL-2 IL-4 IL-10 IFN TNF治疗前 治疗12 周 治疗前 治疗12 周 治疗前 治疗12 周 治疗前 治疗12 周 治疗前 治疗12 周焦虑组 0.9±0.2 7.7±1.6①② 1.2±0.3 2.8±0.6①② 4.1±0.8 8.2±1.9①② 1.2±0.3 3.0±1.1①② 5.6±0.9 9.6±1.9①②对照组 2.4±0.5 9.2±1.8② 3.4±1.0 4.1±1.5② 6.6±1.3 11.5±2.0② 1.7±0.4 4.6±0.9② 8.2±1.7 13.2±2.5②空白组 13.0±2.4 - 5.8±1.1 - 15.9±2.7 - 5.8±1.0 - 18.3±2.7 -F/ t 值 33.704 12.326 27.064 16.061 28.109 15.645 29.556 7.552 29.934 17.677 P 值 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.002 0.000 0.000组别

表3 3组外周血淋巴细胞亚群比例的比较（n =45，±s）

表3 3组外周血淋巴细胞亚群比例的比较（n =45，±s）

注：①与对照组比较，P ＜0.05；②与治疗前比较，P ＜0.05。

CD3+CD4+/% CD8+/% CD4+/% CD4+/CD8+治疗前 治疗12 周 治疗前 治疗12 周 治疗前 治疗12 周 治疗前 治疗12 周焦虑组 23.1±2.2 26.0±2.1①② 34.6±3.5 31.3±2.4①② 28.6±2.9 32.8±2.5①② 1.0±0.2 1.2±0.1①②对照组 26.3±2.5 28.9±2.3② 30.8±2.9 27.2±1.9② 32.5±3.3 36.5±2.9② 1.2±0.1 1.4±0.1②空白组 32.2±3.4 - 24.3±2.8 - 40.3±3.7 - 1.6±0.2 -F/ t 值 15.074 10.407 15.415 12.733 16.695 11.267 14.230 12.002 P 值 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000组别

图1 细胞因子流式细胞图

2.3 3组红细胞免疫指标比较

3组治疗前ATERR、NTERR、RBC-C3bRR、RBC-ICR 水平比较，差异有统计学意义（P＜0.05），ATERR、NTERR 和RBC-C3bRR 水平由高到低依次为空白组、对照组和焦虑组，RBC-ICR 由高到低依次为焦虑组、对照组和空白组。与治疗前比较，治疗12 周后焦虑组和对照组ATERR、NTERR 和RBCC3bRR 有所升高，RBC-ICR 下降（P＜0.05）。治疗12周后对照组ATERR、NTERR 和RBC-C3bRR 高于焦虑组，RBC-ICR 低于焦虑组（P＜0.05）。见表4。

表4 3组红细胞免疫指标的比较（n =45，%，±s）

表4 3组红细胞免疫指标的比较（n =45，%，±s）

注：①与对照组比较，P ＜0.05；②与治疗前比较，P ＜0.05。

ATERR NTERR RBC-C3bRR RBC-ICR治疗前 治疗12 周 治疗前 治疗12 周 治疗前 治疗12 周 治疗前 治疗12 周焦虑组 42.3±3.5 47.3±3.0①② 1.0±0.2 1.2±0.2①② 11.2±1.8 13.8±0.9①② 20.3±2.6 16.2±1.8①②对照组 48.6±3.4 51.5±2.4② 1.2±0.2 1.5±0.2② 14.5±1.6 16.2±1.2② 17.6±1.9 14.0±1.5②空白组 56.3±5.6 - 1.8±0.2 - 18.6±1.7 - 11.3±1.2 -F / t 值 14.221 7.334 18.974 14.230 20.050 16.740 21.083 15.194 P 值 0.000 0.002 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000组别

3 讨论

慢性乙型肝炎是我国常见的传染性疾病，不仅对肝细胞造成直接损伤，还会对多系统造成影响，尤其是免疫功能的下降，目前最具有代表性的为细胞免疫和红细胞免疫指标[11-12]。慢性乙型肝炎患者往往病程较长，在疾病状态、家庭和社会压力下容易出现焦虑的状态，随着社会的发展，慢性乙型肝炎合并焦虑症患者的比例呈逐年递增的趋势，该类患者对治疗的配合程度直接影响疗效，但同时焦虑产生的应激对免疫功能产生负性作用，因此在治疗过程中辅以心理疏导对提高疗效、改善患者生活质量具有重要意义[13-14]。

本研究结果显示，与治疗前比较，治疗12 周后焦虑组和对照组IL-2、IL-4、IL-10、IFN 和TNF 水平均有所增加，说明随着治疗时间的延长，细胞因子分泌水平逐渐增加，阿德福韦酯联合胸腺肽可打破机体的免疫耐受，重建患者的免疫功能，效果肯定。治疗前3组各指标水平由高到低均依次为空白组、对照组和焦虑组，与胥德广等[15]的结果一致，验证了焦虑状态对患者的免疫功能产生的负性作用。与治疗前比较，治疗12 周后焦虑组和对照组CD3+CD4+、CD4+和CD4/CD8 有所升高，CD8+下降，佐证了上述细胞因子所得的结果。治疗前3组CD3+CD4+、CD4+和CD4/CD8 水平由高到低依次为空白组、对照组和焦虑组，CD8+由高到低依次为焦虑组、对照组和空白组。ATERR、NTERR、RBC-C3bRR 和RBC-ICR 是 红 细胞免疫的主要指标，对机体免疫过程中的促进与抑制作用敏感性较高，与治疗前比较，治疗12 周后焦虑组和对照组ATERR、NTERR 和RBC-C3bRR 有所升高，RBC-ICR 下降，说明治疗一方面提高红细胞运输及清除免疫复合物的能力，另一方面降低RBC-ICR 的免疫抑制作用。治疗前3组ATERR、NTERR 和RBCC3bRR 水平由高到低依次为空白组、对照组和焦虑组，RBC-ICR 由高到低依次为焦虑组、对照组和空白组，说明焦虑状态同样对红细胞免疫功能产生负性影响。以上结果表明，在治疗慢性乙型肝炎患者前应充分了解患者的心理状态，对SAS 评分较高的患者开展针对性的心理护理，减轻焦虑状态，提高患者对治疗的信心及依从性。

综上所述，阿德福韦酯联合胸腺肽治疗可对慢性乙肝患者的免疫功能进行重建，上调Th1 和Th2 细胞的表达水平，提高细胞免疫及红细胞免疫功能，然而焦虑状态对免疫功能的改善产生负性作用，在抗病毒治疗的基础上可结合心理疏导，从而提高疗效。