黔产毛茛总皂苷的提取方法和工艺优选

黔南民族医学高等专科学校，贵州 都匀 558000

毛茛为毛茛科植物RanuncuLusjaponicusT.的全草，含黄酮类、内酯类、皂苷类及生物碱等活性成分，具有利湿、消肿、退翳、截疟、杀虫的功效，临床主要用于治疗疟疾、黄疸、偏头痛、胃痛、风湿关节痛、鹤膝风等疾病[1]。在贵州水族聚集地区亦被广泛用于治疗牙痛、风湿关节痛及疟疾，水药译名骂搞[2]，具有良好的开发应用前景。其所含总皂苷具有抗心肌肥大、降血压、抗肿瘤、抗心肌缺血、扩张血管等广泛生物活性[3-10]，齐墩果酸型三萜皂苷是产生上述生物活性的物质基础。本试验拟以黔产毛茛为样本，总皂苷含量为考察指标，优选毛茛总皂苷的提取方法和工艺，以期为进一步开发利用黔产毛茛和建立毛茛的质量控制标准提供理论依据。

1 材料与试药

1.1 试药 毛茛采于贵州省都匀市大坪镇，经黔南民族医学高等专科学校中药教研室李香副教授鉴定为毛茛科植物毛茛RanuncuLusjaponicusT.的全草。齐墩果酸对照品(批号：151015，成都克洛玛生物科技有限公司)。余试剂均为分析纯。

1.2 仪器 Cary 100型双光束紫外-可见分光光度计(北京安捷伦公司)；SG-4050C型数显恒温水浴锅(上海硕光公司)；G80F20CN-B8型微波炉(格兰仕集团)；AE240型电子分析天平(瑞士MettLer公司)；AS10200A 型超声波清洗机(杭州汇尔公司)。

2 方法与结果

2.1 样品溶液的制备 取干燥至恒重过三号筛的毛茛粉末约3 g，置125 mL圆底烧瓶中，加入95%乙醇20 mL，回流3 h，过滤，用容量瓶定容至50 mL，摇匀。精密量取20 mL置蒸发皿中挥散溶剂，残渣加10 mL蒸馏水溶解，用水饱和正丁醇萃取三次，每次10 mL，合并正丁醇液，蒸干。残渣加少量甲醇溶解并转移至50 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀。精密吸取1 mL溶液至100 mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，摇匀，备用[11]。

2.2 对照品溶液的制备 精密称取干燥至恒重的齐墩果酸对照品6.0 mg，置于25 mL容量瓶中，加入甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，配置得的对照品溶液。

2.3 标准曲线的绘制 精密吸取对照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mL分别加入7支干燥具塞磨口试管中，水浴挥干溶剂，分别加入5%香草醛-冰醋酸溶液0.4 mL，高氯酸1.6 mL，于70 ℃恒温水浴加热20 min，取出，流水冷却3 min，加入冰醋酸5 mL，摇匀，随行试剂空白，于542 nm波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，齐墩果酸质量浓度(mg/mL)为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程Y=2.527 2X-0.081 1，r=0.9993。对照品溶液在0.024～0.168 mg/mL范围内呈良好的线性关系。

2.4 精密度实验 精密吸取对照品溶液0.5 mL至干燥具塞磨口试管中，按“2.3”项下方法操作，测定吸光度，重复测定5次，结果RSD值为0.21%，表明仪器精密度良好。

2.5 稳定性实验 精密吸取样品溶液2.5 mL至干燥具塞磨口试管中，按“2.3”项下方法显色，并在显色后1、2、3、4、5、6、7 h测定吸光度。结果RSD值为0.79%，表明样品溶液显色后在7 h内保持稳定。

2.6 重复性实验 取干燥至恒重过三号筛的同一毛茛粉末3 g，6份，按“2.1”项下制备样品溶液，精密吸取样品溶液2.5 mL至干燥具塞磨口试管中，按“2.3”项下方法操作，测定吸光度，计算总皂苷含量，结果RSD值为1.10%，表明该实验方法重复性良好，结果见表1。

表1 重复性实验 (n=6)

2.7 加样回收率实验 取已知含量的同一毛茛粉末约1.5 g，6份，每份样品中分别加入适量齐墩果酸对照品，按“2.1”项下方法制备样品溶液，按“2.3”项下方法操作，测定吸光度，计算回收率，结果回收率平均值为98.20%，RSD值为1.49%，结果见表2。

表2 加样回收率测定结果 (n=6)

2.8 样品含量测定 精密吸取样品溶液2.5 mL各5份至干燥具塞磨口试管中，按“2.3”项下方法操作，于542 nm处测定吸光度，测得药材中总皂苷含量为(44.88±0.71)mg/g(n=5)。

2.9 提取方法考察 称取9份过三号筛干燥至恒重的毛茛粉末各约3 g，选取水、甲醇、95%乙醇为提取溶媒，溶剂用量30倍，分别采用超声、回流、微波法提取30 min，按“2.1”项下制备样品溶液，按“2.3”项下测定样品溶液的吸光度，结果见表3。

表3 不同溶媒和提取方法总皂苷的含量 (mg/g，n=3)

结果显示：同一提取方法，95%乙醇为溶媒与水、甲醇为溶媒对总皂苷的提取率影响具有差异(P<0.05)，以95%乙醇为溶媒提取率高；以95%乙醇为溶媒，回流法提取与超声法提取、微波法提取对总皂苷提取率影响具显著性差异(P<0.01)，以回流提取法高。确定毛茛总皂苷以95%乙醇为溶媒，回流法提取为佳。

2.10 提取工艺优选 结合单因素分析预试验考察结果，设定提取次数为2次、提取温度为80℃，选取乙醇体积分数(A)、液固比(B)、提取时间(C)为考察因素，各因素取3水平。称取9份黔产毛茛样品，L9(34)正交设计表进行试验，因素水平见表4，实验安排及结果见表5，采用SPSS 13.0统计软件对结果进行处理，方差分析见表6，以直观分析和方差分析判断各因素对毛茛总皂苷提取率的影响，筛选最佳工艺。

表4 因素与水平

表5 正交实验安排表及结果

表6 方差分析

注：F0.01(2，2)=99.0，F0.05(2，2)=19.0。

由表5可知，影响毛茛总皂苷提取率的因素顺序为A>C>B，结合K值，可选择提取工艺为A2B3C1。表6方差分析结果表明：乙醇体积分数(A)和提取时间(C)对提取率影响显著(P<0.05)，液固比(B)影响不显著，故确定提取的最优工艺条件为：A2B1C1，即回流法提取，以85%乙醇为溶媒，用量10倍，在提取温度80℃条件下提取2次，每次2 h。

2.11 验证试验 称取黔产毛茛样品5份，按优选的提取方法和工艺进行提取，毛茛总皂苷提取率为54.49±0.23 mg/g，与优选前“2.8”项下样品含量测定的提取率具显著性差异(P<0.01)；RSD=1.68%，表明优选的提取方法和工艺是合理、可行的。

3 讨论

预试验对药材提取液进行了直接测定和比色法测定比较，结果显示：直接测定齐墩果酸对照品在205 nm有最大吸收，但样品在此处容易被其他物质干扰；比色法测定对照品和样品在542 nm均有最大吸收，且无其他物质干扰，因此选择比色法进行测定。

试验利用皂苷类成分具有溶于水、甲醇、乙醇等极性较大溶剂的化学性质，考察了上述3种溶剂分别采用回流、超声、微波3种提取方法下总皂苷提取率的差异性，经统计分析后，确定提取方法。结合前期预实验对毛茛总皂苷的乙醇体积分数、液固比、提取时间、提取次数和提取温度的考察结果，采用正交试验设计法考察该提取方法下总皂苷提取工艺，经直观分析和方差分析后，确定最优提取工艺。该设计方案较为全面地考察了影响毛茛总皂苷提取的各种因素，结果准确、重复性好、专属性强，避免了采用单一溶媒、单一提取方法评价总皂苷提取方法和工艺的局限性。