8个厂家74批次丹参片中脂溶性成分丹参酮ⅡA的含量比较研究

秦学玲1 蒋新平2 马 娜1 杨璐璐3 秦兴卫4

1.云南省食品药品监督检验研究院，云南 昆明 650011；2.云南百康药业有限公司，云南 昆明 650106； 3.中国人民解放军联勤保障部队第九二〇医院，云南 昆明 650032；4.昆明赛诺制药股份有限公司，云南 昆明 650011

丹参片是《中国药典)一部收载的品种，具有活血化瘀的作用, 用于瘀血闭阻所致的胸痹，症见胸部疼痛、痛处固定、舌质紫暗；冠心病心绞痛见上述证候者[1-5]。军事训练伤急性损伤后期或软组织慢性损伤，有瘀斑或瘀血并伴肿痛，口服丹参片有活血化瘀及缓解肿痛的作用。研究表明，丹参中的活性成分主要有脂溶性的丹参酮类和水溶性的酚酸类成分[6-14]。丹参片在中国药典2015年版一部中的含量测定项为HPLC法测定丹参中丹酚酸B的含量，而丹参片的另一类主要成分即脂溶性成分未作相应的含量测定控制[1]。而且临床应用中发现，不同厂家生产的丹参片质量和疗效存在很大差异，为此，本实验运用HPLC法对本次国家评价性抽验的8个不同厂家74批次丹参片样品，在检测波长为270 nm下对脂溶性成分丹参酮ⅡA的含量进行了测定研究。通过方法学验证，该方法操作简便、准确，重复性好，为丹参片的整体质量控制监管提供科学依据；并采用频数分布图和箱形图对其含量进行比较分析，现报道如下。

1 仪器与试药

高效液相色谱(HPLC)岛津LC20AT系统；天平：Mettler AE240电子天平(瑞士梅特勒公司)；对照品丹参酮ⅡA(批号：110766-201520标示量为98.9%)购自中国食品药品检定研究院；甲醇为色谱级(美国Merck公司)，水为重蒸水(自制)，其它试剂均为国产分析纯；丹参片为2015年国家评价性抽验抽取的样品。

2 溶液制备

2.1 对照品溶液 精密称取丹参酮ⅡA对照品22.36 mg，置100 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，再精密量取1 mL，置100 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，制成每1 mL含22.11 μg的溶液，即得。

2.2 供试品溶液 取本品10片，糖衣片除去糖衣，研细，取约1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇溶液50 mL，称定重量，超声处理30 min(功率：280 w；频率：40 kHz)，放冷至室温，再称定重量，用甲醇溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，用0.45 μm微孔滤膜滤过，即得。

2.3 阴性样品溶液 取缺丹参的丹参片阴性样品，按“2.2”项下的方法，制得阴性样品溶液，即得。

3 方法与结果

3.1 色谱条件 色谱条件与系统适用性试验 色谱柱：Aglient C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色谱柱；流动相：甲醇-水(75∶25); 柱温30 ℃;流速为1 mL·min-1;检测波长270 nm。进样量：10 μL。在此色谱条件下，丹参酮ⅡA对照品，样品和缺丹参的阴性样品的分离色谱图如图1所示。

3.2 线性关系考察 分别精密量取2.1项下配制的对照品溶液 1 mL、1 mL、1 mL、2 mL、3 mL、20 mL至25 mL、10 mL、5 mL、5 mL、5 mL、25 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，得线性关系各浓度对照品溶液。精密吸取上述各浓度对照品溶液10 μL，注入液相色谱仪进行测定，以进样量(μg)为横坐标(x)，峰面积为纵坐标(y)，绘制标准曲线，得到丹参酮ⅡA的回归方程为：y=3813.8x+36.125(R2=1.0000)线性范围为0.00885～0.221 μg。结果表明线性关系良好。

3.3 精密度试验 取对照品溶液③，连续进样6次，每次10 μL，测定峰面积值，结果丹参酮ⅡA峰面积的RSD为0.01%。表明仪器精密度良好。

3.4 稳定性试验 取同一供试品溶液分别于0、2、4、12、16和24 h进样10 μL进行测定，结果丹参酮ⅡA峰面积的RSD为0.01%。表明供试品溶液中的待测成分丹参酮ⅡA在室温放置24 h内基本稳定。

3.5 重复性试验 取同一批丹参片样品(批号:150305)，按“2.2”项下的方法平行制得6份供试品溶液，在上述色谱条件下进样10 μL进行测定并计算，结果平均含量值为1.037 mg·g-1,RSD为和0.02%。表明其重复性良好。

3.6 回收率试验 取丹参片样品(批号:150305)适量，精密称取6份，每份约0.5 g， 置具塞锥形瓶中，精密加入丹参酮ⅡA对照品溶液⑦ (质量浓度为176.91 μg·mL-1)3 mL，再精密加入甲醇溶液50 mL，按“2.2”项下的方法制备供试品溶液，进样10 μL进行测定。结果丹参酮ⅡA平均回收率(n=6)为99.6%，RSD为0.02%。表明该方法的回收率良好。

3.7 样品的测定 取8个厂家74批次丹参片样品，按“2.2”项下的方法制备供试品溶液，在上述色谱条件下进样10 μL进行测定，计算含量，结果见表1和图2。

表1 74批次丹参片中丹参酮ⅡA的含量测定结果 (mg·片-1)

3.8 结果 由表1和图2可以看出，8个厂家74批次丹参片中丹参酮ⅡA含量变化幅度较大，批间差异明显，最高含量为每片0.6533 mg，最低含量为每片0.0484 mg，最高者为最低者的13.5倍； B企业和F企业样品中丹参酮ⅡA含量明显高于其他企业；D企业和H企业样品中丹参酮ⅡA含量居中；A企业、C企业E企业和G企业样品中丹参酮ⅡA含量明显偏低；其中D和H企业存在明显的批间差异。

4 讨论

4.1 提取溶剂的选择 分别以甲醇、体积分数为50%甲醇、70%甲醇和90%甲醇超声提取30 min。结果以甲醇提取效率最高，故选择甲醇为提取溶剂。

4.2 提取方法的选择 以甲醇为提取溶剂，分别进行超声15、30和60 min及加热回流0.5、1和2 h。实验结果表明，超声提取与加热回流提取效果相当，超声30 min与60 min效果相当，故提取方法确定为超声提取30 min。

4.3 流动相种类的选择 分别以①甲醇-体积分数为0.1%的甲酸；②甲醇-体积分数为0.1%的磷酸；③乙腈-体积分数为0.1%的甲酸；④乙腈-体积分数为0.1%的磷酸；⑤甲醇-水；⑥乙腈-水对供试品溶液进行了含量测定。实验结果表明，采用甲醇-水作流动相效果最佳。

4.4 检测波长的选择 我们参考相关文献和中国药典，选用λ=270 nm作为丹参酮ⅡA含量测定的检测波长。