蛤蚧及其混伪品基于12S rRNA序列的Bar-HRM鉴定研究△

苏燕燕，丁丹丹，马婷玉，向丽

中国中医科学院 中药研究所 中药鉴定与安全性检测评估重点实验室，北京 100700

蛤蚧为我国名贵动物中药材，其基原为壁虎科Gekkonidae壁虎属动物蛤蚧(又名大壁虎)GekkogeckoLinnaeus，以除去内脏的干燥全体入药，具有止咳、平喘、保肝、降血糖、提高机体免疫力及激素样作用[1-4]，为临床常用补虚药[5-6]。因市场需求增大、人们大肆捕捉及生存环境的改变，蛤蚧野生资源骤减，现已列为国家二级保护动物和广西省一级保护动物，市场上蛤蚧多为进口和养殖。由于蛤蚧、藏蛤蚧等形态相似，导致同名异物、同物异名的情况较为严重，市场常见壁虎、藏蛤蚧、石龙子、蜥蜴等混伪品[7-11]。近年来，越来越多的蛤蚧粉、蛤蚧胶囊等未经检验的药材在电商平台出售，严重威胁临床用药安全，亟需一种准确高效的鉴别方法规范药材市场、保障药材安全。

高分辨率熔解曲线(High Resolution Melting，HRM)技术是指采用饱和荧光染料，结合实时荧光定量PCR技术，通过核酸熔解曲线分析，进而实现基因检测、基因型分析的新型分子诊断技术[12-14]。因其具有灵敏度高、检测快速、闭管操作避免污染、可实现高通量检测、可选择性测序等优点，逐渐应用于基因突变扫描、基因型分析、单核苷酸多态性(SNP)分析等研究[15-18]。此外，结合DNA barcoding的Bar-HRM技术逐渐形成，并成功应用于沙棘、蜂蜜等中药、食品的鉴定研究中，具有重要应用价值[19-21]。

目前，蛤蚧相关的HRM鉴定研究未见报道，而动物通用条形码线粒体细胞色素c氧化酶亚基I基因(cytochrome c oxidase subunit I，COI)序列长度大于600 bp，相较之下，片段长度约400 bp且能实现蛤蚧与混伪品鉴别的12S核糖体核糖核酸(Ribosomal Ribonucleic Acid，rRNA)基因序列则更为适宜[22-25]。因此，本研究以蛤蚧与其6种常见混伪品为研究对象[11，26-27]，基于12S rRNA序列对其进行HRM鉴别研究，并对市售蛤蚧粉进行检测，以验证该方法的可行性，完善了中药蛤蚧的分子快速鉴定体系。

1 材料

1.1 实验样品

本研究所用动物样品共48份，其中，蛤蚧10批次30份；蛤蚧常见混伪品无蹼壁虎Gekkoswinhonis、疣尾蜥虎Hemidactylusfrenatus、喜山岩蜥Laudakiahimalayana、石龙子Eumeceschinensis、东方蝾螈Cynopsorientalis和红瘰疣螈Tylototritonshanjing各3份。此外，购买市售蛤蚧粉10份。动物样品均经中国科学院昆明动物研究所蒋珂助理研究员鉴定，凭证标本保存于中国中医科学院中药研究所。本研究共得48条12S rRNA序列，均已提交至NCBI核酸数据库(表1)。

表1 蛤蚧及其混伪品样品信息

1.2 仪器及试剂

Scientz-48高通量组织研磨仪(宁波新芝生物科技股份有限公司)；Qubit 3.0荧光定量仪[赛默飞世尔(美国)科技有限公司]；Rotor-Gene Q MDx实时定量PCR仪[凯杰(德国)生物技术有限公司]；血液/组织/细胞基因组DNA提取试剂盒[天根生化科技(北京)有限公司]；HRM分析试剂盒[天根生化科技(北京)有限公司]；T-A克隆试剂盒[宝生物工程(大连)有限公司]。

2 方法

2.1 DNA提取

采用试剂盒法提取样品总DNA[26]。所有样品DNA均利用Qubit 3.0测定浓度，并调整为30～50 ng·μL-1。采用微量紫外分光光度计测定样品DNA质量，OD260/280处于1.8～2.0的为优质；保存于-20 ℃冰箱备用。

2.2 蛤蚧12S rRNA序列扩增及数据分析

以10批次蛤蚧样品DNA为模板，进行12S rRNA序列扩增[24]，采用凝胶电泳法检测扩增结果，送北京诺赛基因组研究中心有限公司双向测序。

通过软件CodonCode Aligner V3.0对10批次蛤蚧的12S rRNA序列峰图进行拼接剪切，在NCBI比对验证后采用MEGA 6.0进行序列分析。

2.3 蛤蚧及其混伪品HRM-PCR扩增与Bar-HRM数据分析

以10批次蛤蚧的主要单倍型和6种常见混伪品的DNA为检测对象。

HRM-PCR体系为25 μL，包含2×HRM PCR master mix 12.5 μL，正反向引物L1091/H1478(2.5 μmol·L-1)各1 μL，以1 μL DNA为模板，加RNase-Free Water补充至25 μL。

HRM-PCR反应条件为94 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min，52 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，循环35次；PCR反应完成后进入扩增产物的HRM曲线分析程序：熔解温度从75 ℃逐渐升至95 ℃，每变化0.15 ℃收集一次荧光信号。蛤蚧及其混伪品的HRM-PCR产物均经测序验证。

2.4 蛤蚧及其混伪品Bar-HRM数据分析

实验中获得的高分辨率熔解曲线均通过Rotor-Gene Q MDx version 2.3.1.49(QIAGEN GmbH，Hilden，Germany)进行分析；蛤蚧与其6种常见混伪品的HRM-PCR产物均经测序验证，并采用MEGA 6.0进行序列分析。

2.5 灵敏度检测

任取1份蛤蚧DNA，将质量浓度调整为50 ng·μL-1，并稀释为25、10、5、1 ng·μL-1的DNA溶液，进行HRM-PCR实验，研究DNA模板浓度与鉴定结果的关系。

2.6 蛤蚧掺伪检测

以0、1%、5%、10%、25%、50%、75%、100%的比例将无蹼壁虎DNA与蛤蚧DNA混合，以掺伪DNA为模板进行HRM-PCR扩增，设蛤蚧为对照样品，研究DNA掺伪比例与HRM曲线的关系。

2.7 市场蛤蚧粉鉴定

在市场购买10份蛤蚧粉，取样约45 mg，以试剂盒法提取总DNA。利用HRM技术对其进行检测：每份设置3个物理重复，以蛤蚧对照药材DNA为阳性对照，并测序验证。针对出现套峰的样品进行T-A克隆检测。

3 结果

3.1 蛤蚧12S序列分析

10批次30条蛤蚧12S rRNA序列，长度均为396 bp，可分为2种单倍型(图1)，其中，单倍型H1有21条，单倍型H2有9条；共存在5个变异位点，分别为64位点的C-T变异，211位点的T-A变异，228位点的C-T变异，325位点的G-A变异和358位点的A-G变异。表明序列较为保守。

3.2 蛤蚧及其混伪品HRM分析

因10批次30份蛤蚧样品中仅存在2种单倍型，因此，每种单倍型任选3份DNA与6种混伪品共同进行HRM实验。根据图2可知，蛤蚧与6种混伪品的12S rRNA-HRM曲线均具有不同的形状特点，在归一化熔解曲线(图2A)和差异化熔解曲线(图2B)中，蛤蚧的2种单倍型均可区分开，但相对于无蹼壁虎、疣尾蜥虎、喜山岩蜥、石龙子、东方蝾螈和红瘰疣螈6种混伪品，蛤蚧的2种HRM曲线聚在一起。无蹼壁虎、石龙子和红瘰疣螈的HRM曲线分别只有一种，表明这3个物种分别只有一种单倍型。而3份疣尾蜥虎的HRM曲线呈现出相近的2种，则

注：H1和H2表示不同单倍型。图1 蛤蚧不同单倍型12S rRNA序列

该样品的12S rRNA序列有2种单倍型；3份东方蝾螈和3份喜山岩蜥(藏蛤蚧)的HRM曲线均出现较小的差异，可能存在序列差异很小的不同单倍型，或者因实验操作中加样量不均一而导致曲线出现微小差异，需测序验证。总体而言，蛤蚧及其6种常见混伪品均可通过HRM曲线进行鉴别区分。

注：A.归一化熔解曲线；B.以蛤蚧为参考基因型的差异化熔解曲线。图2 基于12S rRNA序列蛤蚧与常见混伪品的HRM曲线

3.3 蛤蚧及其混伪品DNA barcoding分析

所有HRM-PCR产物均经测序验证。实验共得48条12S rRNA序列，其中蛤蚧30条，混伪品18条，所有12S rRNA序列均在NCBI核酸数据库进行BLAST比对验证，比对到的最相近物种为自身物种，比对值为99%～100%。序列特征见表2。蛤蚧和6种常见混伪品的序列长度均小于400 bp，其中，无蹼壁虎的序列长度最长，为399 bp；喜山岩蜥的最短，为362 bp；蛤蚧的序列长度为396 bp。7个物种的平均GC碱基含量(鸟嘌呤G和胞嘧啶C在DNA 4种碱基中所占的比率)在40%～50%，其中，疣尾蜥虎的平均GC碱基含量最高，为50.0%；东方蝾螈的最低，为41.4%；蛤蚧的平均GC碱基含量为43.5%。

在本研究的7个物种中，无蹼壁虎、石龙子、东方蝾螈和红瘰疣螈共4个物种的12S rRNA序列分别只有1种单倍型，种内无变异位点，序列较为保守；蛤蚧、疣尾蜥虎和喜山岩蜥分别有2种单倍型，其中，蛤蚧的12S rRNA序列含5个变异位点，喜山岩蜥有1个变异位点，疣尾蜥虎存在18个变异位点，种内差异较大；与HRM曲线分析结果相符。根据种内、种间遗传距离分析结果显示，7个物种的种内最大遗传距离均小于其种间最小遗传距离，表明蛤蚧及其6种混伪品可通过遗传距离分析进行鉴别。此外，在NJ树图中(图3)，蛤蚧和6种常见混伪品分别聚为一支，而且，自展支持率都高达99%，表明，蛤蚧及6种常见混伪品可通过构建NJ树准确区分。

因此，经测序验证，基于12S rRNA序列的DNA barcoding分析，蛤蚧与其6种常见混伪品可准确鉴别，而且各物种间也能准确区分，与HRM曲线分析结果相符，表明基于12S rRNA序列的HRM技术可实现蛤蚧及其6种常见混伪品的准确区分。

3.4 灵敏度分析

为研究DNA浓度对鉴定效果的影响，将蛤蚧DNA浓度调整为50、25、10、5、1 ng·μL-1，以此系列浓度DNA为模板进行HRM-PCR扩增。图4显示不同浓度蛤蚧样品的HRM曲线聚在一起(图4A)，Tm值为(81.11±0.03)℃(图4B)，表明DNA浓度为1～50 ng·μL-1的蛤蚧样品均可通过HRM-PCR检出，且结果稳定。

表2 蛤蚧及常见混伪品12S rRNA序列特征

注：bootstrap 1000次重复，仅显示自展支持率≥50%。图3 基于12S rRNA序列蛤蚧及其混伪品的系统进化NJ树

注：A.归一化熔解曲线；B.DNA熔解曲线。图4 基于12S rRNA序列蛤蚧HRM曲线灵敏度检测

3.5 掺伪检测

设置0、1%、5%、10%、25%、50%、75%、100%的DNA掺伪比例(无蹼壁虎/蛤蚧)，研究HRM技术对物种的检出能力。不同掺伪比例得到的曲线不同(图5)，以蛤蚧的HRM曲线为基准，曲线相似性随着掺伪比例的增大而降低，当掺伪比例为1%时，该HRM曲线的相似性为99.07%(表3)。结果表明，基于12S r RNA序列的HRM曲线可实现蛤蚧的掺伪检测，最低检测限可达1%；而且，曲线相似性分析结果，对推算掺伪比例具有一定指导意义。

表3 不同掺伪比例HRM曲线基因型置信百分比 %

3.6 市场蛤蚧粉鉴定

在市场购买了10份蛤蚧粉，以基于12S rRNA序列的HRM技术其进行初步检测，以鉴定其真伪。每份样品进行3个物理重复，10份蛤蚧粉得30条HRM曲线(图6)。其中，SY8的3条曲线单独聚在一起，SY4、SY5、SY7的9条曲线聚为一类，其余6份样品的18条HRM曲线聚为另一类，没有与已知蛤蚧12S rRNA序列完全相同的样品。推测曲线聚为一起的蛤蚧粉来源接近。经测序验证，10份蛤蚧粉的测序峰图均出现不同程度的套峰，具体表现为部分位点出现套峰，底峰较高。对出现套峰的样品进行T-A克隆检测，10份市场蛤蚧粉均检测到多种蛤蚧单倍型，表明所购蛤蚧粉为混合样品。

此外，SY1、SY2、SY3、SY6、SY9、SY10曲线呈现异常，经Qubit 3.0测定DNA浓度低于1 ng·μL-1，表明DNA降解严重，其原因可能为：炮制过程中温度过高或时间过久；药材存放时间较久；药材肌肉组织含量少，如去尾后的蛤蚧。而且，经多次T-A克隆检测，比对到羽螨属Proctophyllodessp.物种和黑粪蚊。样品疑似不洁。结合价格分析，SY6价格最低，为0.39元/g，另外5份售价为0.67～0.74元/g；而SY4、SY5、SY7和SY8的售价分别为0.60、0.56、0.56、1.60元/g，检测结果无异常。推测SY1、SY2、SY3、SY9、SY10有以次充好的可能。

注：A.归一化熔解曲线；B.以蛤蚧为参考基因型的差异化熔解曲线；C.DNA熔解曲线。图5 基于12S rRNA序列蛤蚧掺伪检测HRM曲线

注：A.归一化熔解曲线；B.以蛤蚧为参考基因型的差异化曲线；C.DNA熔解曲线。图6 市售蛤蚧粉HRM曲线

4 讨论

蛤蚧作为我国名贵动物中药材，相关鉴定研究多有报道，常用鉴定方法为形态鉴定、显微鉴定、理化鉴定等传统鉴定方法[11，28-29]。形态鉴定和显微鉴定均需要长期从事中药鉴定工作的专家完成，专业难度大，不易掌握；目前未发现蛤蚧的专属特征性成分，《中华人民共和国药典》中也未收载相关成分的含量测定方法，鉴定难度大。

目前，以DNA barcoding和特异性PCR方法为代表的分子鉴别技术较为高效。张红印、GU等[26，30]均通过COI序列对蛤蚧及其10种易混物种和伪品进行了DNA barcoding鉴定研究，也有学者基于蛤蚧及其多种混伪品的COI、16S rRNA、Cytb、12S rRNA片段设计特异引物进行鉴别[25，27，31-32]。但是，DNA barcoding技术的精准鉴定主要依赖于PCR产物的测序，若大宗中药材均采用测序检测，一则检测周期延长，二则测序成本高。而且，存放较久的样品、炮制品以及深加工后的中成药，因DNA降解，很难经传统PCR扩增到较长的DNA片段，如700 bp左右的COI序列。特异性PCR检测方法对于掺伪品则无法准确鉴别。

本研究以蛤蚧与其6种常见混伪品为研究对象，采用HRM技术进行鉴定研究。HRM技术灵敏度高，理论上可实现单个碱基的差异分析，且检测快速[12，18，33]。结果显示，蛤蚧、疣尾蜥虎和喜山岩蜥分别生成了2种峰型的熔解曲线，推测存在不同的单倍型，经测序验证，与熔解曲线分析结果相符。因此，通过HRM鉴别，可实现同一个物种不同单倍型的区分，检测灵敏度和特异性较强。而且，经Barcoding验证分析，蛤蚧与6种混伪品均能通过BLAST分析、遗产距离分析、NJ树分析区分开，表明蛤蚧及其6种常见混伪品可通过基于12S rRNA序列的Bar-HRM方法进行高效鉴别。

基于12S rRNA序列，对蛤蚧和无蹼壁虎进行掺伪检测，根据曲线相似性分析，掺伪比例为1%时，曲线相似性为99%，表明掺伪最低检测限可达1%。而Sakaridis等[34]针对驴肉的掺伪检测研究，显示出了更高的灵敏度，最低掺伪比例仅为0.1%。虽然不同物种、不同片段的扩增偏好性不同，但曲线相似性分析结果，对于评估药材是否掺伪及掺伪比例仍具有一定参考价值。经对10份市场蛤蚧粉检测发现，其中6份DNA浓度较低，且在后续T-A克隆检测中发现螨属和黑粪蚊物种，疑似存放不当，造成污染。

本研究基于12S rRNA序列建立的蛤蚧的Bar-HRM鉴别方法，为蛤蚧的快速鉴别、蛤蚧药材的掺伪检测及其质量评价提供了一定的技术支持，但蛤蚧的12S rRNA序列长度约为400 bp，对于深加工后的相关产品则很难检测，还需进一步开发片段进行研究。