HO-1通过下调TLR4介导的炎性反应抑制ox-LDL诱导的VSMC泡沫样变*

尹延伟，孙倩倩，沈 勇，胡爱民，王 琦，陈大伟，赵炫柱，石 进△

(1.空军特色医学中心神经内科，北京 100142;2.北京卫戍区第九离职干部休养所 100021;3.武警河北省总队医院综合病房，石家庄 050081;4.空军特色医学中心急诊部，北京 100142)

动脉粥样硬化是多种心脑血管疾病、外周血管疾病发生的病理基础[1]。炎性反应在动脉粥样硬化病变过程中发挥着重要的作用[2]。研究证实动脉粥样硬化斑块中泡沫细胞的形成与脂质代谢紊乱及炎性反应密切相关[3]。因此，积极探讨炎性反应在泡沫细胞形成过程中的机制和关键的调控分子，对寻找防治动脉粥样硬化的新靶点具有重要意义。

血红素加氧酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)在抑制体内氧化应激及炎性反应方面发挥重要的作用。近年研究表明HO-1在动脉粥样硬化发生发展中起到关键的作用[4]。Toll样受体4(Toll like recepter 4,TLR4) 是人体启动先天性免疫和炎性反应的重要模式识别受体，其在人体中主要表达于巨噬细胞、单核细胞和树突状细胞等免疫细胞表面，同时在动脉壁的内皮细胞、血管平滑肌细胞 (vascular smooth muscle cells,VSMCs)、纤维原细胞等表面也有表达。TLR4可通过激活下游核因子-κB(NF-κB)炎症信号通路参与机体的动脉粥样硬化炎性反应过程[3,5]。本研究在C57BL/6J背景野生型小鼠与TLR4基因敲除(TLR4-/-)小鼠中对HO-1在VSMCs泡沫样变过程中的具体作用进行探讨，旨在为动脉粥样硬化的防治提供新的理论依据，现报道如下。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物 4～8周龄C57BL/6J背景野生型小鼠与TLR4-/-小鼠分别购自陆军特色医学中心野战外科研究所实验动物中心与上海南方模式生物科技发展有限公司，无特定病原体(SPF)级环境饲养。实验用小鼠均为雄性小鼠。实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。

1.1.2主要试剂 DMEM培养液、胰酶购自美国Hyclone公司、胎牛血清(FBS)、青素溶液、链霉素溶液氧化型低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein,ox-LDL)购自广州奕源生物有限公司；β-actin一抗、TLR4一抗、HO-1一抗购自美国Santa Cruz Biotechnology公司；油红O、HO-1激动剂钴原卟琳(CoPPIX)、HO-1抑制剂锌卟啉(ZnPPIX)购自美国Sigma公司；山羊抗小鼠二抗购自上海碧云天生物技术有限公司；IL-6、TNF-α酶联免疫吸附试验(ELISA)检测试剂盒购自美国R&D Systems公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养与实验分组 小鼠麻醉后取胸主动脉，组织贴块法培养原代VSMCs。VSMCs均匀接种于培养皿中，用含10% FBS和1%青链霉素的DMEM培养液在37 ℃、5% CO2的细胞培养箱中培养；采用胰酶消化液进行传代，选取3～6代状态良好的细胞进行实验。按实验要求进行分组：空白对照组：VSMCs不加任何干预因素；ox-LDL组：加ox-LDL (80 μg/mL)刺激72 h；TLR4-/-+ox-LDL组：TLR4-/-VSMCs加ox-LDL(80 μg/mL)刺激72 h；CoPPIX+ox-LDL组：CoPPIX(50 μmol/L)预先处理VSMCs 12 h后再加入ox-LDL(80 μg/mL)刺激72 h；ZnPPIX+ox-LDL组：ZnPPIX(50 μmol/L)预先处理VSMCs 12 h后再加入ox-LDL(80 μg/mL) 刺激72 h。

1.2.2油红O染色 各组VSMCs首先用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤3次，然后用10%多聚甲醛固定VSMCs 20 min，在避光条件下用油红O工作液染色VSMCs 30 min，最后应用去离子水冲洗VSMCs后显微镜下观察。

1.2.3胆固醇水平的检测 VSMCs胆固醇水平的检测方法依据XUE等[6]的研究。各组VSMCs首先在离心管中应用萃取液(100 μL异丙醇)提取脂质成分；然后应用超声破碎仪将VSMCs充分破碎，在1 500×g条件下离心10 min，收集离心管中的上清液；最后采用酶法检测VSMCs中胆固醇水平。测定的结果根据细胞蛋白水平进行标准化。

1.2.4Western blot 细胞裂解法提取各组VSMCs蛋白并定量检测；50 μg蛋白样品上样，经电泳、转膜、封闭后，加一抗(HO-1一抗稀释比例1∶1 000；TLR4一抗稀释比例1∶1 000；β-actin一抗稀释比例1∶1 000)4 ℃孵育过夜，缓冲液洗脱后，加二抗(1∶2 000)室温孵育2 h，缓冲液洗脱。应用化学发光法曝光，最后应用Lab4.6软件对扫描的Western blot图像进行数据分析。

1.2.5ELISA VSMCs培养液中炎症因子水平的检测方法依据本课题组之前的研究[7]。简而言之，首先收集 VSMCs培养液，设定标准孔、对照孔、待测样品孔，酶标板上覆膜，室温条件下静置2 h，倒尽板孔中的液体并洗涤5次；然后每个板孔中添加100 μL IL-6或TNF-α偶联物，加盖覆膜，室温静置2 h；倒尽板孔中液体并再次洗涤5次；每个板孔中添加100 μL底物溶液，于暗室(室温条件下)静置30 min；最后每个板孔中添加100 μL终止液，摇晃反应3～5 min；用酶联免疫检测仪记录450 nm处吸光度(A)值。

2 结 果

2.1ox-LDL显著促进VSMCs细胞内脂质的聚集 VSMCs与ox-LDL共同孵育72 h后，VSMCs内有大量脂滴形成，符合泡沫细胞的形态特点；而空白对照组VSMCs内未见脂滴形成。此外，细胞胆固醇水平测定结果也显示，与空白对照组VSMCs相比，ox-LDL组VSMCs细胞内胆固醇水平显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)，见图1。

A:油红O染色；C:胆固醇水平检测；C:TLR4 Western blot及其表达分析；D:IL-6表达水平检测;E:TNF-α表达水平检测；a:P<0.05，与空白对照组比较

图1VSMCs泡沫样变及胆固醇、TLR4、IL-6、TNF-α表达水平的检测

A:油红O染色；B:胆固醇水平检测；C:HO-1表达水平检测；a:P<0.05，与空白对照组比较；b:P<0.05，与ox-LDL组比较

图2VSMCs泡沫样变、细胞内脂质聚集情况及HO-1表达水平的检测

A:TLR4 Western blot及其表达分析；B:IL-6表达水平检测;C:TNF-α表达水平检测；a:P<0.05，与空白对照组比较；b:P<0.05，与ox-LDL组比较

图3VSMCsTLR4、IL-6、TNF-α表达水平的检测

2.2ox-LDL刺激通过激活TLR4介导的炎性反应促进VSMCs泡沫样变 ox-LDL组中ox-LDL刺激较空白对照组显著诱导了VSMCs内大量脂滴聚积，也显著上调了TLR4及其介导的炎症因子(IL-6、TNF-α)的表达水平，差异均有统计学意义(P<0.05)；而对于TLR4-/-+ox-LDL组，ox-LDL刺激较空白对照组并不能有效促进VSMCs内脂滴聚积；此外，ox-LDL刺激也不影响TLR4-/-VSMCs内TLR4及其介导的炎症因子(IL-6、TNF-α)的表达水平，差异均无统计学意义(P>0.05)，见图1、图3。

2.3激活HO-1抑制ox-LDL诱导的VSMCs泡沫样变 用CoPPIX预先处理VSMCs激活HO-1后再加入ox-LDL刺激，CoPPIX+ox-LDL组VSMCs内脂滴聚积明显较ox-LDL组减轻；而用ZnPPIX预先处理VSMCs抑制HO-1后再加入ox-LDL刺激，ZnPPIX+ox-LDL组VSMCs内脂滴聚积情况较ox-LDL组更加明显，差异均有统计学意义 (P<0.05)，见图2。

2.4HO-1下调TLR4介导的炎性反应抑制ox-LDL诱导的VSMCs泡沫样变 用CoPPIX预先处理VSMCs激活HO-1后再加入ox-LDL刺激，CoPPIX+ox-LDL组并不能有效上调TLR4及其介导的炎症因子(IL-6、TNF-α)的表达水平，与空白对照组比较差异均无统计学意义(P>0.05)；进一步应用ZnPPIX预先处理VSMC抑制HO-1后再加入ox-LDL刺激，ZnPPIX+ox-LDL组TLR4及其介导的炎症因子(IL-6、TNF-α)的表达水平较ox-LDL组上调更加明显，差异均有统计学意义(P<0.05)，见图3。

3 讨 论

动脉粥样硬化是一种动脉血管进行性堵塞的慢性疾病。动脉粥样硬化作为多种心脑血管疾病、外周血管疾病发生的共同病理基础[1]，目前其已经成为世界范围内引起死亡的主要原因之一。因此，积极探讨动脉粥样硬化发生发展的具体机制对动脉粥样硬化相关性疾病的防治具有重要的指导意义。泡沫细胞的形成是动脉粥样硬化病变发生发展过程中非常重要的病理过程[3]。泡沫细胞主要来源于巨噬细胞及VSMCs。然而，相比巨噬细胞，目前关于VSMCs源性泡沫细胞形成的具体机制研究很少。

慢性炎性反应是动脉粥样硬化病变发生、发展的一大病理基础[3]。TLR4 是启动免疫和炎性反应的重要膜受体，其在体内引发炎性反应方面发挥至关重要的作用。有研究显示TLR4参与动脉粥样硬化病变的发生发展过程，并与泡沫细胞的形成密切相关[3,5,7]。本研究中，笔者成功应用ox-LDL刺激C57BL/6J背景野生型小鼠来源VSMCs诱导其泡沫样变，并检测TLR4及其介导的炎性反应。结果提示ox-LDL刺激在明显诱导VSMCs泡沫样变的同时可显著激活TLR4及其介导的炎性反应；而对于TLR4-/-小鼠来源的 VSMCs，ox-LDL刺激并不能有效诱导VSMCs的泡沫样变，此外ox-LDL刺激也不能有效激活TLR4-/-小鼠来源VSMCs内炎性反应。说明VSMCs泡沫样变过程中伴随着TLR4介导的炎性反应激活，而TLR4缺陷损害ox-LDL对VSMCs泡沫样变的促进作用。以上结果进一步说明了TLR4介导的炎性反应在VSMCs泡沫样变的过程中发挥非常重要的作用。

HO-1是动物体内重要的保护性蛋白，在人体血管内皮细胞、巨噬细胞及VSMCs等细胞内均有表达，可被各种化学和生理应激所激活，如炎性反应、氧化应激反应及内毒素等。有研究表明HO-1可能参与了动脉粥样硬化病变中TLR4介导的炎性反应的调控，如激活HO-1可能通过影响TLR4介导的炎性反应而抑制VSMC增殖与迁移[8-10]。但VSMC中激活的HO-1是否通过影响TLR4介导的炎性反应参与VSMC内脂质聚积和细胞的泡沫样变过程，目前还未见有文献报道。基于以上研究笔者推测：激活HO-1可通过干扰TLR4介导的炎性反应而影响VSMC泡沫样变。为了验证以上假设，笔者应用HO-1激动剂和抑制剂分别激活和抑制HO-1表达，观察HO-1表达变化对ox-LDL诱导的VSMCs泡沫样变的影响，同时检测TLR4及其介导的炎性反应激活情况。结果显示激活HO-1显著抑制ox-LDL诱导的VSMC泡沫样变，而抑制HO-1进一步促进ox-LDL诱导的VSMC泡沫样变；同时在激活HO-1状态下，ox-LDL刺激不能有效激活TLR4及其介导的炎性反应，而抑制HO-1后再加入ox-LDL刺激，TLR4及其介导的炎性反应较单独ox-LDL刺激激活更加明显。说明激活HO-1可通过下调TLR4介导的炎性反应抑制ox-LDL诱导的VSMCs泡沫样变。

综上所述，本研究发现在VSMC泡沫样变过程中HO-1可通过下调TLR4介导的炎性反应抑制VSMCs对脂质的摄取进而阻碍泡沫样变的发生。以上结论为动脉粥样硬化相关性疾病的防治提供了新的理论基础。