线粒体钙单向转运体在小鼠心肌肥厚损伤中的作用*

王 晶，张 珍，曹雅男，滕艳杰△

(牡丹江医学院:1.医药研究中心；2.第一临床医学院，黑龙江牡丹江 157011)

心血管疾病是全球死亡的常见原因之一,近年来我国心血管病疾病的患病率和病死率逐年上升，心血管病已成为我国居民的首位死亡原因[1]。有研究表明，心肌肥厚是导致心血管疾病发生率和病死率增高的独立危险因子，是众多心血管疾病的共同病理过程[2]，其发生机制尚未完全阐明，认为与细胞内Ca2+稳态失衡有密切关系。因此，抑制心肌肥厚对改善心脏损伤极其重要。线粒体是心肌细胞能量的来源，在细胞内钙的调节中起重要作用[3-4]。国外最新的研究结果表明，线粒体钙单向转运体(mitochondrial calcium uniporter,MCU)是线粒体内膜上的一个蛋白复合体，其成分由MCU、MCUb、MICU1 MICU2及EMRE构成[5-6]，能够介导Ca2+从细胞质进入到线粒体基质，在细胞内Ca2+信号转导、Ca2+稳态、线粒体能量代谢和细胞凋亡通路方面具有重要意义。异丙肾上腺素(isoproterenol，ISO)是β受体激动剂，可以通过激活MAPK信号通路导致心肌肥厚，与手术造模方法相比较，皮下注射ISO对小鼠损伤小，动物模型成功率高，同时也更加简单、经济、可靠[7]。目前，MCU对心肌肥厚的作用研究多是通过体外实验得到的结果，而在人体或动物体内MCU的作用研究较少，本实验旨在小鼠探讨MCU基因敲除对ISO诱导心肌肥厚损伤的影响，为MCU在心肌肥厚损伤中发挥保护作用提供更多的理论依据，现报道如下。

1 材料与方法

1.1主要试剂与仪器 ISO(上海阿拉丁公司)；生理盐水、Masson染色试剂盒(南京建成试剂公司)；RNA提取试剂盒(美国Omega试剂公司)；反转录试剂盒(美国Roche公司)；苏木素-伊红(HE)染色试剂(北京中生瑞泰公司)；Bcl-2、Bax、caspase-3、caspase-9-PCR引物(上海生工生物工程公司)；荧光定量PCR仪、S100 PCR自动系列化分析仪及Molecular Imager 凝胶成像系统(美国Bio-Rad公司)；光学显微镜(日本Olympus公司)。

1.2方法

1.2.1实验动物分组与处理 无特定病原体(SPF)级雄性CD1野生型小鼠及MCU基因敲除小鼠各16只，体质量(30±5)g，鼠龄12周，由中国军事医学科学院潘欣博士后赠送，动物许可证号:SCXK(军)2012-0004。按照体质量分为4组，每组8只。分别为正常对照组、野生造模组、敲除对照组和敲除造模组。参照文献[7]方法操作，在禁食12 h后，根据体质量，造模组小鼠皮下注射ISO 5 mg/kg，每天早晚各注射1次，间隔12 h，对照组小鼠以等容积的生理盐水进行皮下注射，各组连续注射14 d。试验结束后，采用颈椎脱臼法将小鼠处死，取心脏和肺称质量并记录。随后将小鼠各组部分心脏的心房切掉，然后再分离左心室和右心室，将分离的左心室装入1.5 mL的EP管中并放在液氮中保存，最后按顺序放入指定的盒子里并放入-80 ℃冰箱冷冻；各组另一部分小鼠的心脏放入装有4%多聚甲醛溶液的5 mL EP管中固定，等待组织包埋。

1.2.2心质量/体质量比(HW/BW)、肺质量/体质量比(LW/BW)检测 据测量的小鼠心质量、肺质量及体质量，计算HW/BW、LW/BW。

1.2.3实时荧光定量PCR 用RNA提取试剂盒提取各组小鼠心肌组织总RNA，反转录成cDNA。PCR反应体系包括cDNA 2.0 μL、SYBR Green Mix 9.0 μL、引物各0.8 μL和超纯水7.4 μL，总体积20.0 μL。PCR反应扩增条件：95 ℃预变性10 min，95 ℃变性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸10 s,共40个循环。计算Ct 值、 2-△△Ct值 。以β-actin为内参,引物序列如表1。

表1 PCR扩增引物序列

1.2.4HE染色 将多聚甲醛固定的心脏组织常规脱水，透明，石蜡包埋，用feica旋转式切片机切片，厚度4 μm，行HE染色。步骤如下，65 ℃ 烘片4 h。将石蜡切片放入二甲苯溶液中，浸泡6 min后取出，再放入另1个二甲苯溶液中浸泡6 min。乙醇水化，苏木素染剂浸泡10 min，盐酸乙醇溶液浸泡3 s，蒸馏水稍洗20 s，0.04% 氨水溶液返蓝30 s，伊红染色，自来水冲洗，乙醇脱水，二甲苯透明，中性树脂封片。

1.2.5心肌纤维化的检测 同1.5切片，进行Masson染色。步骤如下，65 ℃ 烘片4 h。将石蜡切片放入二甲苯溶液中，浸泡6 min后，再放入另1个二甲苯溶液中浸泡6 min。切片放入 Bouin 液，然后放入37 ℃的温箱内2 h ，取出后用蒸馏水冲洗，至切片上的黄色消失。青石蓝染色液滴染2 min后，自来水冲洗。苏木素染色液滴染 2 min后，自来水冲洗。酸性乙醇分化20 s后，蒸馏水冲洗10 min。丽春红滴染10 min，蒸馏水冲洗。磷钼酸溶液处理10 min，直接滴入苯胺蓝染色5 min。将切片用弱酸溶液处理 2 min,95% 乙醇快速脱水,100% 乙醇溶液反复浸泡3次，每次10 s，二甲苯溶液反复浸泡3次，每次2 min，最后中性树脂封片。

2 结 果

2.1ISO诱导的心肌肥厚模型的鉴定

2.1.1小鼠HW/BW和LW/BW的改变 与各自对应的对照组比较，两造模组小鼠HW/BW、LW/BW均升高，差异均有统计学意义(P<0.05)。与野生造模组比较，敲除造模组小鼠HW/BW、LW/BW明显升高，差异均有统计学意义(P<0.01)，见图1。

2.1.2小鼠心肌肥厚标志物表达的改变 与各自对应的对照组比较，两造模组小鼠ANP、BNP mRNA的表达均明显升高，差异均有统计学意义(P<0.01)；与野生造模组比较，敲除造模组小鼠ANP、BNP mRNA表达明显升高，差异均有统计学意义(P<0.01)，见图2。

2.1.3小鼠心肌组织形态学的改变 正常对照组小鼠心肌组织心肌肌原纤维细胞排列整齐、致密、形态完整，细胞核及核仁结构清晰；野生造模组小鼠肌丝排列紊乱、松散心肌细胞体积明显增大，形态不规整，细胞核深染、增大、畸形，核仁模糊；与野生造模组比较，敲除造模组小鼠心肌组织病理改变更为明显，见图3。

2.2MCU基因敲除对ISO诱导小鼠心肌肥厚心肌纤维化的影响 正常对照组小鼠心肌组织胶原分布均匀，相邻的胶原纤维网完好，胶原纤维的含量少；野生造模组心肌内胶原纤维明显增多，胶原纤维网断裂，排列紊乱；与野生造模组比较，敲除造模组小鼠心肌纤维化面积明显增加。见图4。

A:LW/BW;B:HW/BW;a：P<0.05，b：P<0.01

图1ISO对HW/BW和LW/BW的影响

A:ANP;B:BNP;a：P<0.05

图2ISO对小鼠心肌肥厚标志物表达影响

2.3MCU基因敲除对ISO诱导小鼠心肌肥厚凋亡相关基因表达的影响 与各自对应的对照组比较，两造模组小鼠Bax、caspase-3、caspase-9 mRNA的表达明显升高，Bcl-2的表达明显降低，差异均有统计学意义(P<0.01)；与野生造模组比较，敲除造模组小鼠Bax、caspase-3、caspase-9的表达明显升高，Bcl-2的表达明显降低，差异均有统计学意义(P<0.05)，见图5。

A：正常对照组；B：野生造模组；C：敲除对照组；D：敲除造模组

图3MCU基因敲除ISO诱导的小鼠心肌胞厚心肌组织形态学的影响(HE×100)

A：正常对照组；B：野生造模组；C：敲除对照组；D：敲除造模组

图4MCU基因敲除对ISO诱导小鼠心肌肥厚心肌纤维化的影响 (Masson×100)

A:Bax;B:Bcl-2;C:caspase-3;D:caspase-9；a:P<0.05；bP<0.01

图5MCU基因敲除对ISO诱导小鼠心肌肥厚凋亡相关基因表达的影响

3 讨 论

心肌肥厚是各种生理或病理刺激下心脏的适应性反应，但是，慢性心肌肥厚会使心脏功能逐渐减退，并最终发展为心律失常、心力衰竭，甚至猝死[8]。随着分子生物学时代的到来，心肌肥厚在基因水平上研究的不断深入，多个基因被发现在心肌肥厚中发挥重要作用[9]。小鼠心肌肥厚模型的构建主要有手术和药物两种方式，手术方式死亡率高、效率低，药物方法更为简单、方便。ISO是儿茶酚胺类β肾上腺素受体激动药之一，半衰期相对较长，能更真实的模拟自然病程，而且皮下注射ISO也更为简单、经济。研究表明，交感神经系统的过度兴奋，主要的原因是通过增加压力/容量负荷而诱导心肌肥厚的发生发展。而在构建心肌肥厚的动物模型中也证明了这一点，使小鼠的交感神经系统兴奋也成为构建小鼠心肌肥厚模型的主要方法[7,10-11]。

MCU基因敲除小鼠，除体形上较野生型小鼠小表型上与野生型小鼠几乎没有变化。基础代谢方面MCU敲除小鼠同野生型小鼠一样。在离体心脏缺血-再灌注损伤中，MCU敲除小鼠与野生型小鼠比较，梗死面积无差异，且功能损伤也无差异；但在骨骼肌上，表现为产能的缺陷[12]。随后的研究表明野生型小鼠和MCU基因敲除小鼠心功能在静息和应激情况下，二者心功能正常[13]。但近年来也有报道显示，在心肌细胞中，敲除MCU基因，可增加MCU复合体的活性，促进心肌细胞凋亡，降低心肌功能[14-15]。

本实验结果显示，模型组小鼠HW/BW、LW/BW明显增加，ANP、BNP mRNA的表达升高，HE染色出现肌丝排列紊乱、形态不规整，证实本实验ISO诱导心肌肥厚造模成功。实验中，经ISO干预后，MCU基因敲除小鼠HW/BW、LW/BW较敲对照组增加，ANP、BNP mRNA的表达较敲除对照组均显著升高；Masson染色出现心肌组织纤维化病变，胶原沉积显著；与各自对照组比较，两模型组Bax、caspase-3、caspase-9 mRNA的表达均上调，Bcl-2的表达下降，而与野生造模组比较，敲除造模组以上变化更明显。提示MCU基因敲除可加重ISO诱导的心肌肥厚损伤，使心肌纤维化面积增加，并促进心肌细胞凋亡，说明MCU具有保护心肌的作用。