壮药依肝达对免疫抑制小鼠免疫功能的影响*

2019-09-16 01:38李以军张文涛郑作文
重庆医学 2019年16期
关键词:补体免疫抑制淋巴细胞

李以军,张文涛,郑作文△

(1.广西医科大学附属民族医院药剂科,南宁 530001;2.广西中医药大学药理教研室,南宁 530200)

壮药依肝达是由饭汤子、田基黄、三姐妹3味药组成,其中饭汤子具有清热利湿、活血止血的功效;田基黄有散瘀止痛、清热利湿、消肿解毒的功效;三姐妹具有发散风寒、解毒、消肿止痛的功效。三味药在广西地区广泛用于治疗急慢性肝炎[1-3]。依肝达以饭汤子为公药,田基黄与三姐妹为母药组成复方中药,用于乙型肝炎治疗,课题组前期研究已证实其不仅能抗乙型肝炎病毒[4-6],而且有保肝降酶的作用[7],故本实验以免疫抑制小鼠为模型,观察依肝达对免疫抑制小鼠免疫功能的影响,以阐明依肝达是通过直接抑制病毒、保肝护肝及增强免疫功能三个方面协同起到治疗乙型肝炎的,为进一步研究其作用机制提供药理学基础,现报道如下。

1 材料与方法

1.1动物、试剂及仪器 无特定病原体(SPF)级昆明小鼠,体质量18~22 g,雌雄兼用,购自广西医科大学实验动物中心(生产许可证号:SCXK桂2009-0002),适应喂养3 d后进行实验。环磷酰胺(江苏恒瑞医药股份有限公司,批号H32020857);刀豆蛋白(ConA,美国Sigma公司,批号C8110);印度墨水(北京市西中化工厂,批号060524);盐酸左旋咪唑片(桂林南药股份有限公司,批号120202);RPMI-1640培养基(美国Gibco公司,批号1243097);2,4-二硝基氯苯(DNCB,成都西亚化工股份有限公司,批号201002161);紫外分光光度计(美国PeiRinElmer公司);电子天平(德国Sartorius公司,型号BP211D);酶标仪(奥地利Sunrise公司);高速低温离心机(德国Biofuge Stoctos 公司)。

1.2方法

1.2.1药物的制备 依肝达浸膏:由广西中医药大学药学院药剂教研室制备。制备方法:取三姐妹200 g、饭汤子300 g、田基黄150 g,混匀后用10倍体积量95%乙醇浸泡2 h后水浴回流提取1.5 h,趁热过滤,药渣继续用8倍体积量95%乙醇水浴回流提取1.0 h,趁热过滤,再合并两次滤液浓缩得40.4 g黑棕色浸膏,1.0 g浸膏相当于13.6 g生药量。依肝达高剂量:取10.0 g浸膏(相当于136.0 g生药量)用纯净水溶解稀释定容至160 mL,得0.85 g生药/mL;依肝达中剂量:取高剂量依肝达加纯净水稀释1倍;依肝达低剂量:取中剂量依肝达加纯净水稀释1倍。

1.2.2依肝达对免疫抑制小鼠血清溶血素(IgM)水平的影响 将SPF级昆明小鼠按体质量分为空白组(生理盐水),模型组(生理盐水),阳性组(左旋咪唑0.5 g/kg),依肝达高、中、低剂量组(依肝达剂量分别为17.00、8.50、4.25 g生药/kg),每组12只小鼠。各组灌胃给药,1次/d,连续10 d,给药体积均为20 mL/kg。除空白组外,其余各组小鼠从给药第1天起,每2天背部皮下注射环磷酰胺溶液,剂量0.4 g/kg。在第5天,每只小鼠腹腔注射5%(v/v)的鸡红细胞悬液0.2 mL。小鼠末次给药1 h后,拔眼球取血,离心制备血清,参照血清IgM的检测方法[8],先用生理盐水将血清稀释500倍后取0.5 mL加入试管中(空白对照用生理盐水代替血清),再依次加入0.5 mL的5%鸡红细胞悬液、10%补体(采集3只豚鼠血,混合分离血清,用生理盐水稀释成10%浓度)、生理盐水,充分混匀后,37 ℃孵育1 h,3 000 r/min离心5 min,取上清液测量其540 nm处光密度值(OD)值,按下面公式计算IgM水平以HCIgM表示。HCIgM=标本血清的OD值×稀释倍数。

1.2.3依肝达对免疫抑制小鼠巨噬细胞吞噬功能的影响 末次给药1 h后,参照巨噬细胞吞噬功能测定方法[9],各组小鼠尾静脉注射10%印度墨水(0.1 mL/10 g)。分别于注射后2 min(t1)、10 min(t2)用毛细管从眼眶取血0.02 mL,加入含2 mL 0.1% Na2CO3溶液的试管中混匀,在波长600 nm下测OD值(得OD1、OD2值)。然后取出肝和脾称质量,按下面公式计算吞噬指数K值和吞噬系数α值。 K=(lgOD1-lgOD2)/(t2-t1),α=1/3×K×体质量/(肝质量+脾质量)。

1.2.4依肝达对免疫抑制小鼠补体C3、C4水平的影响 末次给药1 h后小鼠眼球取血,低温分离血清,当日送往广西中医药大学第一附属医院检测补体C3、C4水平。

1.2.5依肝达对免疫抑制小鼠迟发型超敏反应的影响 各小鼠第1天给药后均腹部脱毛,并在脱毛部位均匀涂上1% DNCB 丙酮溶液致敏。末次给药1 h后,在各小鼠右耳均匀涂抹1% DNCB 丙酮溶液,24 h后处死小鼠,剪下左、右耳壳,用8 mm打孔器在双耳同一部位打下耳片并称质量,计算左、右耳片质量差值。

1.2.6依肝达对免疫抑制小鼠脾淋巴细胞增殖作用的影响 于末次给药后第2天处死小鼠,参照脾淋巴细胞增殖实验方法[10],无菌环境中取脾,用无菌D-Hanks 液冲洗后,200目不锈钢细胞筛过滤,细胞液1 000 r/min离心,弃上清液,加入红细胞裂解液,吹打混匀后离心,弃上清液,用D-Hanks 液洗涤2次后转移至含10%小牛血清RPMI-1640培养液中,于CO2培养箱中培养2 h,培养液中悬浮着脾淋巴细胞,小鼠脾巨噬细胞贴壁生长,分离脾淋巴细胞后,将细胞浓度调成1×107/mL,加入96 孔板,每孔100 μL,再加入含有ConA的培养液100 μL,使ConA终浓度为10 μg/mL。置培养箱培养44 h,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测,用酶标仪在波长570 nm 处测OD值。

2 结 果

2.1依肝达对免疫抑制小鼠血清IgM水平的影响 模型组小鼠的血清IgM水平低于空白组,差异有统计学意义(P<0.01)。与模型组比较,阳性组,依肝达高、中、低剂量组IgM水平均有显著提高,差异均有统计学意义(P<0.01)。见表1。

表1 依肝达对小鼠IgM水平的影响

a:P<0.01,与空白组比较;b:P<0.01,与模型组比较;-:无数据

2.2依肝达对免疫抑制小鼠巨噬细胞吞噬功能的影响 模型组小鼠吞噬指数K与吞噬系数α较空白组降低,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01),说明免疫抑制小鼠模型制备成功。与模型组比较阳性组小鼠的吞噬指数K与吞噬系数α升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较,高剂量依肝达组小鼠吞噬指数K与吞噬系数α也升高,与模型组比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 依肝达对小鼠巨噬细胞吞噬功能的影响

a:P<0.05,b:P<0.01,与空白组比较;c:P<0.05,与模型组比较;-:无数据

2.3依肝达对免疫抑制小鼠血清补体C3、C4水平的影响 模型组小鼠血清补体C3、C4水平与空白组比较,差异有统计学意义(P<0.05),说明免疫抑制小鼠模型制备成功。与模型组比较,阳性组小鼠血清补体C3、C4水平均增高,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01);依肝达高、中、低剂量组C3水平均升高,差异有统计学意义(P<0.01),但对C4水平并无影响,见表3。

表3 依肝达对补体C3、C4水平的影响

a:P<0.05,与空白组比较;b:P<0.05,c:P<0.01,与模型组比较;-:无数据

2.4依肝达对免疫抑制小鼠迟发型超敏反应的影响 模型组小鼠左、右耳质量差值与空白组比较明显下降,差异有统计学意义(P<0.01),提示迟发超敏反应降低,免疫抑制小鼠模型制备成功。与模型组比较,阳性组小鼠左、右耳质量差值显著增高,依肝达高剂量组左、右耳质量差值显著增高,差异均有统计学意义(P<0.05),见表4。

2.5依肝达对免疫抑制小鼠脾淋巴细胞增殖作用的影响 模型组小鼠脾淋巴细胞增殖能力较空白组显著降低,差异有统计学意义(P<0.01),说明免疫抑制小鼠模型制备成功。阳性组与依肝达高、中、低剂量组小鼠脾淋巴细胞增殖能力较模型组均显著提高,差异有统计学意义(P<0.01)。见表5。

表4 依肝达对小鼠迟发超敏反应的影响

a:P<0.01,与空白组比较;b:P<0.05,与模型组比较;-:无数据

表5 依肝达对脾淋巴细胞增殖的影响

a:P<0.01,与空白组比较;b:P<0.01,与模型组比较;-:无数据

3 讨 论

机体免疫功能低下是乙型肝炎患者的表现之一[11],主要原因是体内免疫功能长期处于耐受状态,不能清除病毒而导致,针对乙型肝炎的治疗,需从抑制病毒、保肝护肝和增强机体免疫功能3个环节同时入手。壮药依肝达作为复方中药,能起到“多环节、多靶点、综合调节”的临床作用,前期研究已发现其能抑制乙型肝炎病毒复制及保肝降酶,故本研究着重探讨其对机体免疫功能的作用。

机体免疫系统由免疫器官、免疫细胞及免疫活性因子构成。免疫器官包括骨髓、胸腺、肝脏、淋巴结、脾和黏膜等,免疫细胞包括巨噬细胞和淋巴细胞,免疫活性因子包括抗体、溶菌酶、补体、免疫球蛋白、细胞因子等,当机体受到外来毒素侵袭时,3个部分的免疫物质会通过协同作用发挥机体防疫功能。

单核-巨噬细胞系统在机体免疫系统中占有很重要的作用,担负着机体非特异性的防御功能,其组成有单核细胞和巨噬细胞,其主要功能是吞噬和杀灭病原菌、对细菌毒素进行灭活、抗原递呈作用及释放干扰素和白细胞介素等细胞因子,参与细胞免疫[12],因此,巨噬细胞的吞噬指数K和吞噬系数α是反映机体非特异性免疫功能的重要指标。实验结果发现,高剂量依肝达(17 g/kg)能提高吞噬指数K及吞噬系数α,与模型组比较差异有统计学意义(P<0.05),提示依肝达能提高巨噬细胞的吞噬功能。

免疫球蛋白包括IgG、IgA、IgD、IgE、IgM,主要存在于血液及组织液当中。当机体被病原微生物等抗原刺激后,免疫球蛋白会与抗原生成抗原-抗体复合物,能有效阻断病原体的致病作用[13]。其中IgM是机体体液免疫应答中最早合成和分泌的抗体,在机体特异性免疫中起到重要作用,它的变化能及时体现B细胞活性状况,是反映机体免疫功能的重要指标之一[14]。实验结果发现,依肝达高、中、低剂量组均能提高免疫抑制小鼠IgM水平,与模型组比较差异有统计学意义(P<0.01),结果提示依肝达能增加免疫球蛋白IgM水平。

补体系统是体内非特异性免疫系统的重要组成部分,C3是补体经典激活途径、替代激活途径和凝集素激活途径都必要的枢纽成分,在血清中诸补体成分中水平最高[15]。C4在血清中诸补体成分中水平仅次于C3,是参与补体传统途径活化的成分,合成于肝细胞和巨噬细胞。C4在激活补体,促进吞噬,防止免疫复合物沉淀和中和病毒等方面发挥作用。实验结果发现依肝达高、中、低剂量组均能提高免疫抑制小鼠补体C3水平,与模型组比较差异有统计学意义(P<0.01),但对C4水平无影响。

迟发型超敏反应是抗原诱导引起的细胞性免疫应答,当效应T细胞与特异性抗原结合反应,引起的以单核细胞浸润和组织损伤为主要特征的炎性反应。此超敏反应发生与抗体和补体无关,而与效应T细胞和吞噬细胞及其产生的细胞因子或细胞毒性介质有关。实验结果发现,依肝达高剂量组能提高免疫抑制小鼠左、右耳质量差值,与模型组比较差异有统计学意义(P<0.05),提示依肝达能增强免疫抑制小鼠迟发型超敏反应。

脾淋巴细胞是体内免疫活性细胞,其增殖和分化能力是评价机体细胞免疫功能的重要指标之一。脾脏中T淋巴细胞是重要的免疫活性细胞,它能被有丝分裂原ConA所激活并向淋巴母细胞转化,在转化过程中 DNA、RNA及蛋白质合成增加,使细胞分裂增殖,测定体外脾淋巴细胞转化功能是研究细胞免疫功能的重要手段[16]。实验结果发现,依肝达高、中、低的剂量组均能促进免疫抑制小鼠脾淋巴细胞的增殖,与模型组比较差异有统计学意义(P<0.01)。

综上所述,壮药依肝达能提高免疫抑制小鼠的免疫功能,其作用主要包括提高IgM水平,增强巨噬细胞的吞噬功能,提高补体C3水平,增强迟发型超敏反应及脾淋巴细胞增殖活性。

猜你喜欢
补体免疫抑制淋巴细胞
遗传性T淋巴细胞免疫缺陷在百草枯所致肺纤维化中的作用
不同灸法对免疫抑制兔脾脏、胸腺影响的组织学研究
补体因子H与心血管疾病的研究进展
抗dsDNA抗体、补体C3及其他实验室指标对于诊断系统性红斑狼疮肾损伤的临床意义
防控猪群免疫抑制的技术措施
金线莲多糖对免疫抑制小鼠脾淋巴细胞体外增殖、分泌NO及细胞因子的影响
流感患儿血清免疫球蛋白及补体的检测意义
丹参总酚酸对大鼠缺血性脑卒中后免疫抑制现象的改善作用
小鼠胸腺上皮细胞的培养、鉴定及对淋巴细胞促增殖作用的初步研究
乳腺癌原发灶T淋巴细胞浸润与预后的关系