重楼皂苷I对成骨细胞MC3T3-E1增殖及分化的实验研究*

庞 敏，吴 志△，陈 森，牛银波，李 勃，林冠杰

1.广东省湛江市第四人民医院骨科(湛江524008)，2.西北工业大学生命科学院(西安710072)； 3.武警陕西省总队医院(西安710054)

骨质疏松症是一种以骨骼中矿物质水平明显降低、骨骼微结构被破坏以及骨骼脆性增加为特征的疾病。随着我国人口的老龄化，骨质疏松症已经成为一种严重危害中老人身体健康和生存质量的健康问题。2018年，中国卫健委针对骨质疏松症进行了我国第一次流行病学调查。此次调查结果显示，年龄超过50岁的人群骨质疏松症患病率为19.2%，中老年女性骨质疏松问题尤为突出，年龄超过50岁的女性患病率达32.1%，远高于同龄男性的6%，而年龄超过65岁的女性骨质疏松症患病率更是达到了51.6%。骨质疏松症引发的骨折(髋骨、股骨)严重影响了病人的生活质量，增加了个人以及国家的医疗负担，因此，寻找有效的防治措施已经成为医疗科研领域一项亟待解决的问题。 我国的传统医学，中医学对于治疗跌打损伤有着丰富的资源以及经验。重楼又名“七叶一枝花”，为百合科植物，它主要分布在广西、贵州、四川、广东等省，有消肿止痛、败毒抗癌、镇咳平喘、清热定惊等作用。研究者们发现，甾体皂苷是其中主要的生物活性成分；并着重研究以及阐明重楼的抗肿瘤作用与相关机制[1-2]。除了抗肿瘤作用外，重楼作为云南白药的主要成分之一，对骨骼与肌肉的损伤也呈现出良好的效果。因此，重楼皂苷不仅能治疗运动系统的损伤，而且可能防治骨质疏松症的进展。本实验研究重楼皂苷I(Polyphyllin I，PPL I)对小鼠成骨样细胞MC3T3-E1的增殖与成熟及其β-catenin与BMP-2蛋白表达的影响，揭示PPL I防治骨质疏松症的作用并初步探讨其可能的防护机制。

材料与方法

1 材料与试剂 PPL I(分子量为855.02，纯度>98%)从上海瀚香生物科技有限公司购买。小鼠成骨样细胞株MC3T3-E1 (中国科学院上海生化细胞所细胞库)，胎牛血清(美国Thermo Fisher公司)，DMEM培养液(美国Thermo Fisher公司)，胰蛋白酶、EDTA、二甲基亚砜 (DMSO)、MTT (均购于美国Sigma公司)，骨形态发生蛋白2(BMP-2)，β-连环蛋白(β-catenin)及β-肌动蛋白(β-actin)抗体均购自北京博奥森生物有限公司，碱性磷酸酶(ALP)试剂盒 (南京建成生物公司)，EdU试剂盒 (广州瑞博公司)。

2 细胞培养与药物处理 使用加入10% (v/v)胎牛血清的DMEM培养液在37℃、5% CO2的条件中培养MC3T3-E1细胞。将PPL I溶解于DMSO中，配置成浓度为1 mol/L的储藏液。临用前，将其稀释成工作浓度(1、3、10、30 μmol/L)。

3 MTT法观察细胞的增殖 将细胞(2×103/孔)接种于96孔板中，随后放在细胞孵箱中(5% CO2、37℃)培养12 h。随机分为正常对照组：每孔中加入200 μl DMEM培养液(含0.54‰ DMSO)；给药组：每空加入200 μl含PPL I (1、3、10、30 μmol/L) 的培养液。继续培养1d或2d。每孔加入浓度为5 g/L 的20 μl MTT溶液， 继续孵育4h，结束培养。吸干培养液，接着每孔加入150 μl DMSO，充分振荡、完全溶解结晶物。立即使用Bio-Rad ELISA Reader读取培养板在490 nm波长处的吸光值。计算细胞增殖率：细胞增殖率/% =(试验组OD值-对照组OD值)/对照组OD值×100%。

4 EdU法检测细胞增殖 细胞培养方法同上 (为了进一步观察验证PPL I对细胞增殖的作用，参考MTT结果，选择3、10 μmol/L两个促进细胞增殖明显，且对细胞特性无显著影响的浓度)，将含不同浓度的PPL I (3、10 μmol/L)培养液孵育、处理MC3T3-E1细胞2d后，参考说明书进行操作，实验完毕使用奥林帕斯显微镜捕捉处理图像。

5 碱性磷酸酶(ALP) 活性测定 碱性磷酸酶是能够反映成骨细胞分化程度的一种酶。ALP的活性越高，成骨细胞的成骨活性越强；反之亦然[3]。使用24孔板培养MC3T3-E1细胞(2×104/孔)12 h后，更换含有3、10 μmol/L PPL I的新鲜培养液，继续培养2 d或3 d。参考碱性磷酸酶试剂盒说明书进行实验。使用瑞士梅特勒-托利多紫外分光光度计测定各组在520 nm处吸光度；检测每个样品的蛋白含量，结果用U/mg 蛋白表示。

6 茜素红染色 以2×105/孔的密度将MC3T3-E1细胞接种于24孔板内，培养14 d。1次/3d，换用含3、10 μmol/L PPL I的培养液。培养结束后，用预冷PBS 洗涤细胞，70%的酒精固定20 min，吸弃固定液， PBS 清洗细胞样本两次。滴加茜素红 S 染色液(Solarbio公司)， 覆盖样本， 染色 5min。吸去染色液， PBS 洗涤2次。显微镜下观察： 钙沉积阳性细胞呈现桔红色。

7 免疫印迹法检测β-catenin与BMP-2的蛋白表达 待PPL I处理细胞2d后，使用细胞刮刮取收集细胞。以RIPA Lysis Buffer(江苏碧云天公司)提取细胞蛋白，用Bradford 法测定蛋白浓度。确定每孔的蛋白上样量为30 μg，接着在120 V电压下，行凝胶电泳，分别使用6%的浓缩胶与12%的分离胶进行样本的浓缩与分离，采用NC膜进行转膜。以PBST做溶剂，配置5%脱脂牛奶溶液，在室温下封闭硝酸纤维素膜2 h后，加入β-catenin (1∶500)、BMP-2 (1∶500)及β-actin (1∶500) 一抗，放入冰箱冷藏室(4℃)中孵育12 h。使用PBST洗膜3次，10 min/次，加入HRP标记二抗(稀释比例1∶6000)，室温孵育1 h，充分洗膜后，使用美国Millipore公司的ECL 发光液进行化学发光，采用Bio-Rad凝胶成像仪采集分析条带。

8 统计学方法 使用单因素方差分析(ANOVA)比较组间差异，选择SPSS 20.0统计学软件进行统计学分析，P<0.05表示有统计学差异。

结 果

1 PPL I可促进MC3T3-E1细胞增殖 PPL I(1、3、10、30 μmo/L)作用细胞24 h、48 h后，成骨样细胞均发生显著地增殖(P<0.01)(图1)：重楼皂苷(1、3、10、30 μmol/L)作用24 h后，MC3T3-E1细胞的增殖率分别为(111. 67 ± 2.52)%、(122. 00 ± 4.58)%、 (130. 33 ± 3.06)%、(142. 00 ± 2.65)% ；48 h后，分别为(123. 33 ± 3.51)%、( 132. 67 ± 2.08)%、(141. 00 ± 2.00)%、(146. 67 ± 3.21)%。 EdU实验结果(图2)也显示，PPL I可以有效地促进MC3T3-E1细胞的增殖。

2 PPL I可上调MC3T3-E1 细胞的ALP活性 将PPL I (3、10 μmol/L)加入培养液，处理细胞 1 d或2d后，细胞中的碱性磷酸酶(ALP)活性均明显上调。在2d与3d时，正常组细胞的ALP活性分别为(0.22 ± 0.01)、(0.23 ± 0.02) U/mg蛋白。而PPL I(3、10 μmol/L)作用1d后，ALP活性分别为(0. 31 ± 0.03)、(0. 34 ± 0.03)U/mg蛋白；2d后，分别为(0.40 ± 0.04)、(0.51 ± 0.03) U/mg蛋白。与对照组相比，均有显著升高(图3)。

图1PPL I对MC3T3-E1细胞增殖的影响(与对照组24 h比较，**P<0.01；与对照组48 h比较，##P<0.01)

图2 EdU检测PPL I对MC3T3-E1细胞增殖的影响 (×100，红色信号显示处于增殖状态的细胞，蓝色信号显示细胞核)

图3 PPL I对MC3T3-E1细胞的碱性磷酸酶活性影响(与对照组48 h比较，**P<0.01；与对照组72 h比较，##P<0.01)

图4 PPL I对MC3T3-E1细胞钙结节(橘红色结节即为钙结节)形成的影响

3 PPL I可促进MC3T3-E1 ALP细胞的成熟 钙沉积和钙化结节的形成是成骨细胞成熟的一种标志。 茜素红S钙染色法是一种通过鳌和技术，使钙离子和茜素红 S 结合形成复合物，进而分析细胞样本中橘红色钙沉积现象的经典方法。如图4所示，PPL I(3、10 μmol/L)作用2周后，MC3T3-E1细胞的钙结节形成明显增高。

4 PPL I可促进MC3T3-E1细胞中β-catenin和BMP-2的蛋白表达 免印迹疫结果显示，PPL I (3、10 μmol/L) 作用48 h后，MC3T3-E1细胞中β-catenin和BMP-2的表达呈浓度依赖性地升高 (图4)。

图5PPL I影响MC3T3-E1细胞β-catenin与BMP-2蛋白表达水平(与对照组比较，**P<0.01)

讨 论

骨质疏松症已经成为世界范围内的一个严重问题。其发病率高居各种疾病的第七位 ，且呈现出逐年增高趋势，该病在65岁以上老年人群中的发病率≥50%[4-6]。骨质疏松早期通常没有明显的临床表现，假如不引起重视，随着病情的进展可引发疼痛、脊柱变形和骨折等情况。其严重并发症是骨折，常见的骨折部位是腰背部、髋部和手臂，致残致死率高，严重影响患者生活质量。骨质疏松症的防治已经成为一个亟待解决的问题。

重楼是我国的传统药材，是云南白药的主要成分之一，在消肿止痛与抗跌打损伤方面有良效。药理学研究发现本品提取物有止血、抗炎、镇静镇痛等功效[1]。重楼中含量最为丰富的一种成分是甾体皂苷，其数量约占所有化合物的80%。因此，我们认为：重楼皂苷不仅能治疗运动系统的损伤，而且可能防治骨质疏松症的进展。

该实验中，MTT结果显示：PPL I可时间、浓度依赖性地促进成骨样细胞MC3T3-E1增殖。EdU试验结果也再次提示PPL I可有效地促进MC3T3-E1细胞增殖。接着，我们通过检测ALP的变化来研究PPL I调节MC3T3-E1细胞的成骨活性的作用。观察到，PPL I明显地升高了细胞中的ALP活性。成骨细胞，在骨基质的合成、分泌和矿化扮演了重要角色，是骨发生与形成的主要功能细胞。茜素红染色实验表明，PPL I可以显著地促进成骨细胞成熟，表现为钙结节形成增多。上述实验表明，PPL I影响调节成骨细胞的增殖与成熟有可能是重楼修复骨骼与肌肉损伤的机制之一。接着，本实验采用分子生物学手段，观察与研究PPL I究竟是怎样影响MC3T3-E1细胞的增殖及分化，以便为重楼与重楼皂苷未来应用于防治骨质疏松的领域，提供一定的理论基础。

Wnt/β-catenin信号通路在骨形成及骨代谢中发挥了重要作用：β-catenin一旦从细胞质进入到细胞核内，即可激活Wnt通路下游的一系列靶基因，随后十分重要地参与调控成骨细胞的增殖、分化与成熟[7-9]。骨形态发生蛋白(BMPs)，可调控成骨细胞的增殖、分化和凋亡，能够诱导骨髓基质干细胞向成骨细胞分化，十分重要地参与调控成骨细胞的分化过程[10-12]。免疫印迹结果表明，PPL I明显地促进了MC3T3-E1细胞中β-catenin与BMP-2的蛋白表达。提示PPL I促进成骨样细胞MC3T3-E1增殖的作用机制之一与其影响Wnt/β-catenin与BMP-2的通路有关。

综上所述，实验发现PPL I可促进成骨样细胞MC3T3-E1的增殖与分化，并上调其成骨活性；PPL I升高了β-catenin和BMP-2的蛋白表达。参考文献以及实验结果：成骨细胞在运动系统损伤修复中发挥了重要作用。我们认为PPL I发挥促损伤修复的可能作用机制之一在于，它能促进成骨细胞的增殖与分化。尽管，PPL I的骨保护作用仍需进一步阐明，然而本研究结果为PPL I在运动系统的损伤修复以及抗骨质疏松中的应用提供了一定实验线索与依据。