白术对猪O 型口蹄疫疫苗免疫效果及抗氧化性的影响

李瑞丽，严 寒，郑小明，万明春

（1.江西省农业科学院农产品质量安全与标准研究所，江西 南昌 330200；2.江西省玉山黑猪原种场，江西 上饶 334700；3. 江西省农业科学院畜牧兽医研究所，江西 南昌 330200）

口蹄疫（Foot-and-mouth disease，FMD）是由口蹄疫病毒引起的猪、牛等偶蹄目动物的一种急性传染病，该病的发生与流行对畜牧业的影响极为严重，往往造成巨大的经济损失。目前世界各国控制口蹄疫较为有效的办法是采用疫苗接种，但是由于多种原因往往造成生产上口蹄疫疫苗免疫的效果不甚理想[1,2]。因此，提高疫苗的免疫效果成为迫切的需要，而免疫佐剂不仅能增强疫苗的免疫应答，而且能驱使动物机体获得有效的保护性免疫。随着近来对佐剂研究的深入，口服佐剂的研究越来越受到重视，因为口服免疫是一种简单易接受的产生全身性免疫的方式，而且黏膜免疫在保护肠道和呼吸道黏膜表面的疫病方面也有主要作用。当然，天然药物免疫佐剂开发也是另一个重点，中草药免疫佐剂是指传统中草药或经过加工提取的含有生物活性物质具有增强机体免疫功能的现代中药制剂[3,4]。现有的研究已经证明，许多中草药作为某些传染病疫苗的佐剂已取得了理想的疗效[5-10]。

白术为我国传统中药材，前期研究证明中药白术能够提高小鼠对于O 型口蹄疫疫苗的免疫反应[11]，本试验进行了中药白术对猪免疫口蹄疫疫苗的免疫效果的研究，为探索中药白术的合理使用提供参考。

1 材料和方法

1.1 试验动物

江西省某养殖场的30 日龄杜长大三元杂交猪50 头。

1.2 试剂及仪器

猪口蹄疫O 型灭活疫苗（OZK/93 株，批 号：1012001）中牧实业股份有限公司生产；中药白术（炒制）购自南昌市汇仁堂药店；猪O 型口蹄疫病毒ELISA 抗体检测试剂盒，购自武汉科前动物生物制品有限责任公司；Sorvall ST 16R型离心机，美国thermo fisher 公司制造；RE-3000 型旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂制造；SHZ-III 型循环水真空泵，上海亚荣生化仪器厂制造；SH-1000 型酶标仪，日本Corona Electric 公司制造；ASE350加速溶剂萃取仪，美国Dionex 公司制 造；Agilent 7890A-7000QqQ 型气相色谱三重串联四极杆质谱联用仪，美国Agilent 公司制造。

1.3 中药白术的制备

白术煎煮剂制备：白术500 g加水2 500 mL 水中浸泡30 min，然后置煎煮容器中，文火煎煮1 h，过滤去渣，再加水2 500 mL 文火煎煮1 h，合并煎液，于65 ℃旋转蒸发，浓缩为相当于原生药材4 g/mL 的药液，全部原药加入淀粉500 g，混合均匀后60 ℃烘干。

1.4 中药白术的质量鉴定

用加速溶剂萃取-气相色谱串联质谱法测定白术煎煮剂中的白术内酯I 和白术内酯III 含量，方法参考Li R L 等人方法[11]。

1.5 试验方法

50 头30 日龄杜长大杂交猪，随机分成5 组，每组10 头，预饲期3 d，采血。然后进行饲喂试验，按照空白对照（标准日粮）、I 组（标准日粮+0.5%粉碎白术），Ⅱ组（标准日粮+1.0%粉碎白术）、Ⅲ组（标准日粮+0.5%煎煮白术）和Ⅳ组（标准日粮+1.0%煎煮白术）进行饲喂，试验期10 d。饲喂结束后12 h 进行称重、免疫，每头猪免疫1 mL 的O 型口蹄疫商品苗，第4 周进行二免，第7 周称重、前腔静脉采血。血样室温静置于4 h 后，于4 ℃冰箱过夜，3 000 r/min 离心3 min，吸取血清分装于0.2 mL 塑料离心管中，-20 ℃保存，检测抗体水平。

1.6 统计分析

数据用xˉ±SD 表示，用SPSS软件进行Duncan 检验，P<0.05 为差异显著。

2 试验结果与分析

2.1 中药白术中白术内酯Ⅰ和白术内酯Ⅲ的含量

图1 显示了标准品（std-1 mg/kg.D）和中药白术（huiren-1.D）中白术内酯Ⅰ和白术内酯Ⅲ的质谱图，测定的试验白术中白术内酯Ⅰ和白术内酯Ⅲ的含量分别为1 391.5 mg/kg 和960.1 mg/kg。

2.2 不同加工处理和剂量的白术对猪O 型口蹄疫疫苗的影响

图1 白术内酯的离子扫描质谱图

表1 显示了猪口蹄疫O 型灭活苗免疫前和二免后3 周猪只的口蹄疫抗体检测结果。由表1 可知免疫前试验各组的口蹄疫抗体水平，对照组、Ⅰ组、Ⅲ组以及Ⅳ组的OD630nm值均＜0.2，低于试剂盒0.4的阳性标准，但是，Ⅱ组有6 头猪的抗体水平较高，OD630nm平均值高于试剂盒0.4 的阳性标准，推测本组猪只的上述结果因为其母源抗体水平较高；与对照组的OD630nm值相比，Ⅰ组、Ⅲ组以及Ⅳ组差异均不显著（P ＞0.05），但Ⅱ组的OD630nm值显著高于对照组（P ＜0.05）。表1 中二免后3 周试验各组的口蹄疫抗体水平的结果可以看出，I 组、Ⅲ组的OD630nm值均显著高于对照组（P ＜0.05），Ⅳ组的OD630nm值与对照组相比差异不显著（P ＞0.05）；Ⅲ组的OD630nm平均值最高，但与其他两个中药组差异不显著（P ＞0.05），可见饲喂经不同加工处理的中药白术对口蹄疫疫苗具有一定的免疫增强作用。此外，试验中Ⅱ组由于母源抗体较高，二免后3 周OD630nm平均值低于试剂盒0.4 的阳性标准，由于情况比较特殊在这将不参与比较。

2.3 不同加工处理和剂量的白术对猪体增重及仔猪腹泻率的影响

表2 列出了整个试验过程中试验猪只的体增重情况，试验各组猪的体增重与对照组相比差异均不显著（P ＞0.05），中药组间猪只的体增重亦无明显差异（P ＞0.05）。试验过程中，对照组和试验Ⅱ组均有1 头仔猪出现了腹泻。

3 讨论

3.1 中药白术对猪口蹄疫疫苗的免疫增强作用

白术作为一味补气中药已经在我国应用数千年，现代药理学研究表明白术对免疫系统具有广泛的免疫调节作用[12]。本试验首先用气相色谱串联质谱的方法测定了白术中白术内酯Ⅰ和白术内酯Ⅲ的含量，分别为1 391.5 mg/kg 和960.1 mg/kg，可作为白术质量控制的重要依据。然后，进行免疫试验，将不同处理方式和剂量的白术添加到试验日粮中，饲喂10 d 后按正常免疫程序进行O 型口蹄疫疫苗免疫，二免3 周后进行抗体检测。结果发现，除了白术Ⅱ组，其他试验组的OD630nm值均高于对照组，其中饲喂添加了0.5%粉碎白术和0.5%煎煮白术的试验猪的口蹄疫抗体水平与对照组比较差异显著（P ＜0.05）。在本试验中，由于采用口服的方式，未见明显不良反应，对试验猪体重的影响也不大。此结果与之前的小鼠试验结果相吻合[11]，说明白术对口蹄疫疫苗的免疫具有一定的免疫增强作用。机体免疫应答是一个十分复杂的生物学过程，这一过程受机体免疫调节机制的控制。免疫调节机制不仅决定了免疫应答的发生与否，而且也决定了免疫应答的强弱。Jerne 于1974 年在“克隆选择学说”的基础上提出了“免疫网络学说”，该学说认为抗原刺激发生之前，机体处于一种相对的免疫稳定状态，当抗原进入机体后打破这种平衡，引起具有抗原受体的细胞克隆活化增殖并产生特异性抗体，同时这种抗原反应细胞自身的Id 又可诱导相应的细胞克隆活化。关晓辉等[14]通过对腹腔巨噬细胞Fc 受体观察，发现白术挥发油可以激活Fc 受体，经白术挥发油激活的巨噬细胞体积明显增大，伸展能力强，表面结合的羊红细胞显著增多，从而增强机体非特异性免疫功能。宋海英等[15]通过定量溶血分光光度测定法指出白术能增强小鼠抗体形成细胞活性，促进B 细胞分化、增殖为浆细胞，增加小鼠血清IgG 含量。本试验中饲喂白术之后，可能通过激活试验猪的免疫细胞，增强了机体非特异性免疫功能，再对试验猪注射口蹄疫疫苗时，就使得机体对抗原的免疫应答有所增强。

表1 免疫前后猪血清中O 型口蹄疫病毒的抗体水平

表2 免疫O 型口蹄疫疫苗对猪体增重的影响

3.2 母源抗体对口蹄疫疫苗的影响

本试验发现，免疫疫苗前有一组猪只（33 日龄）的母源抗体水平较高，而且二免后3 周测定的抗体水平均不能达到试剂盒0.4的阳性标准。高世杰等[16]研究报告指出母源抗体对30 日龄前大部分仔猪特异抗体效价处于保护带（lgX>1.8），45 日龄时，则有半数左右仔猪特异抗体效价处在灰色带（lgX<0.9 ～1.8），他提出45 ～60日龄为接种口蹄疫疫苗的最佳时间。此外，Barteling[17]认为口蹄疫疫苗的免疫效果与疫苗抗原量、抗原毒株和佐剂有关，因此利用型内异源毒株免疫也是克服母源抗体干扰的途径之一。

4 小结

0.5 %的煎煮或粉碎白术添加到基础日粮饲喂10 d，可显著提高O 型口蹄疫疫苗二免后3 周的FMD抗体水平，试验猪未见明显不良反应，对试验猪体重的影响也不大。研究白术提高O 型口蹄疫疫苗的免疫效果的作用机理，尤其是对仔猪黏膜免疫的作用机制是下一步的工作重点。

生产中母源抗体对口蹄疫疫苗免疫失败的影响也值得重视，采用合理的安排免疫时间和利用型内异源毒株免疫都是克服母源抗体干扰的途径。