不同稳定剂配制的三种精浆生化质控品的性能评价*

石汉振，陈雨薇，欧财文，王建兵，柯培锋

(1.广东省中医院检验科，广东广州 510120;2.广州市天河区中医医院检验科，广东广州 510120；3.南方医科大学附属里水医院检验科，广东佛山 528200)

精浆分析是一项用于评估男性生殖能力的重要的检验项目，其检测的项目涵盖许多用于诊断男性不育和男性生殖系统疾病的生化标志物[1]。精浆生化项目检测的准确性对于临床的诊疗判断尤为重要。但是，精浆生化质控品价格昂贵和结果稳定性欠佳等原因导致精浆生化质控品尚未广泛应用于临床；缺乏相应的室内质控标准操作程序文件又导致临床精浆生化分析标准化和质量控制工作难以开展[2]。同一实验室内部或不同实验室之间精浆生化分析结果存在很大的差异[3]，结果的可信度备受怀疑。自2004年以来精浆生化分析标准化和质量控制引起国内外男科专家重视[4-6]，国内外的男科实验室一直致力于精浆生化分析标准化和质量控制研究，但国内尚未研制出均匀、稳定、价廉的质控品。有文献报道，乙二醇、丙三醇是较好的质控品稳定剂、1,2-丙二醇是良好的防冻剂和除冰剂、氯霉素是良好的抑菌剂，因此常常作为临床试验中蛋白类项目质控品的稳定剂及抑菌剂[7-13]。但是这些试剂用于精浆生化质控品的配制尚未见报道，配制后精浆生化质控品的性能是否能满足要求也不清楚。因此，本课题组采用乙二醇、丙二醇、丙三醇作为稳定剂配制精浆生化质控品，对其均匀性、稳定性以及实验室常规质控监测进行评价,以期获得配制精浆生化质控品的最佳配制方法，助力精浆生化室内质控工作的开展，提高结果的准确性。

1 资料与方法

1.1一般资料 采集2017年10月至2018年3月于广东省中医院进行体检的健康男性的精液标本。要求受检者禁欲2～7 d[14]，于取精室手淫取精，收集一次射精的全部精液于清洁、无毒、密闭的容器内，置37 ℃水浴箱中待液化[15]。纳入及排除标准：选取常见传染病(乙型肝炎、丙型肝炎、梅毒、HIV)筛查结果为阴性的男性精液作为标本，剔除生殖道或泌尿道慢性炎症、遗传性疾病、生殖器质性疾病患者的标本。

1.2仪器与试剂 主要的检测仪器为美国Awareness公司Chemwell BRED 2900型全自动精浆生化免疫分析仪。检测试剂包括传染病检测试纸条(艾博生物医药公司生产)、氯霉素(青岛海博生物公司生产)、乙二醇(国药集团化学试剂厂生产)、丙二醇(无锡亚泰化工生产)、丙三醇(无锡亚泰化工生产)。

1.3方法

1.3.1提取精浆 将多份检测后废弃的精液标本用4 000×g离心15 min，取上层精浆。混合10～15份不同受试者的精浆用于制备质控品。为了避免精液液化不良对吸样的影响，需剔除精液液化不良、严重黏稠的标本。离心后精浆不能有浑浊或絮状沉淀。

1.3.2传染病筛查 用乙肝表面抗原、丙肝抗体、梅毒螺旋体抗体、HIV抗体检测试纸条(金标法)检测混合后的精浆标本是否含有相关传染病病毒的抗原或抗体。留取筛查结果阴性的标本待用。

1.3.3补体灭活处理 将传染病筛查结果为阴性的精浆标本置于56 ℃的水浴中30 min，以期进一步灭活病毒[16-17]。

1.3.4实验分组 根据实验中待测精浆质控品中加入稳定剂的种类分成A、B、C三组，分别添加占精浆30%的乙二醇、丙二醇、丙三醇作为稳定剂，三组质控品中均加入5%的氯霉素溶液作为抑菌剂，然后立即用漩涡振荡器将其充分混匀。

1.3.5分装保存 将制好的精浆生化质控品分装于子弹头离心管中，每管400 μL，每次制作150个，置于-20 ℃冰箱冰冻保存。

1.3.6用全自动精浆生化分析仪进行检测 检测项目包括中性α-葡萄糖苷酶、柠檬酸、果糖、锌。

1.4统计学处理 (1)均匀性检验采用SPSS20.0软件进行统计学分析，将测定结果进行单因子方差分析，若F小于自由度为(f1,f2)及给定显著性水平α(通常α =0.05)的临界值Fα(f1,f2)，则表明质控品的均匀性良好。当测量数据样品内均方MS2和样品间均方MS1非常小，所计算出的F超过临界值时，为获得更客观的统计结果，用SS≤0.3δ准则分析，若SS≤0.3δ，则表明质控品的均匀性良好。(2)稳定性检验采用SPSS20.0软件进行统计学分析，将测定结果进行t检验，若t小于自由度为(n-1)及给定显著性水平α(通常α=0.05)的临界值tα(n-1),则表明质控品的稳定性良好。

2 结 果

2.1均匀性检验 A、B、C组精浆生化质控品F均大于2.39(临界值)，P<0.05，差异有统计学意义。进一步用SS≤0.3δ准则分析显示，A组质控品中精浆中性α-葡萄糖苷酶SS>0.3δ，其余各组精浆生化质控品均SS<0.3δ。因此，只有A组质控品中的精浆中性α-葡萄糖苷酶存在明显的瓶间差异。见表1、2。

表1 精浆生化质控品单因素方差分析结果

表2 精浆生化质控品SS≤0.3δ准则分析结果

表3 精浆果糖质控品稳定性检验结果(t)

2.2稳定性检验 A、B、C组精浆生化质控品第8、15、22、29、36天的质控数据与第1天的质控数据进行t检验分析的结果均小于临界值t0.05(5)(为2.57)。说明各组精浆生化质控品稳定性均符合要求。见表3～6。

表4 精浆锌质控品稳定性检验结果(t)

表5 精浆柠檬酸质控品稳定性检验结果(t)

表6 精浆中性α-葡萄糖苷酶质控品稳定性检验结果(t)

表7 精浆生化质控品常规质控监测

2.3常规质控监测 对自制精浆生化质控品连续进行3个月的常规质控监测，得到约20个质控数据，见图1、表7。质控数据显示，以乙二醇、丙二醇、丙三醇为稳定剂制备的精浆生化质控品结果均分布在±3s范围内，CV值的变化均在15%以内。试验发现B组的常规质控CV值均在10%以内，各个项目的稳定性最好。

图1 各检测项目的质控情况

3 讨 论

目前男科实验室质量控制措施薄弱，实验室间精浆生化结果存在较大差异，主要原因是缺乏相应质控品或质控品正在研发过程中[22]。所以,积极开展精浆生化质控品的研究，不仅有利于提高精浆生化结果的准确度，为临床提供准确可靠的结果，同时也可以减少实验室质量控制成本，符合男科实验室质量控制发展的迫切需求，具有巨大的社会和经济价值。

大量研究显示[7-13]，乙二醇和丙三醇、1,2-丙二醇作为质控品稳定剂，氯霉素作为抑菌剂,常常被用于制备蛋白类检测项目的质控品，而精浆生化项目恰好大多为蛋白类物质。本研究用文件CNAS-GL03提供的2种均匀性统计方法评价质控品均匀性。本实验中单因素方差分析结果显示,在 α=0.05 显著性水平，配制的精浆生化质控品都存在瓶间差异。但是，由于测量数据的样品内均方MS2非常小，应进一步用SS≤0.3δ准则进行均匀性分析。由于精浆生化项目为新开展的项目，实验室目前尚无能力评价标准偏差目标值。为此，本研究参照生化项目的能力评价标准偏差目标值的计算方法[23]：总误差(Tea)为参考生化项目的最大变异系数即30%，偏差(Bias)视为0，从而进行精浆生化项目的δ值计算，δ=(TEa-|Bias|)/CV。因此，可见以乙二醇为稳定剂配制的精浆质控品在中性α-葡萄糖苷酶项目上均匀性较差，而以丙二醇、丙三醇为稳定剂配制的精浆生化质控品在各项中均匀性良好。

精浆生化常规质控监测数据显示，以乙二醇、丙二醇、丙三醇为稳定剂配制的精浆生化质控品测定的质控数据均均匀分布在±2s范围内，CV值的变化均在15%[24]以内。但目前卫生部临检中心对精浆生化项目CV值没有明确的规定，因此结合项目的特点参照类似的生化项目(按靶值±15%)进行评价，但下一步研究应根据不同的项目将不同CV值进行区分。因此，以乙二醇、丙二醇、丙三醇为稳定剂配制的精浆生化质控品用于果糖、锌、柠檬酸、中性α-葡萄糖苷酶检测的稳定性均良好。

自配质控品与商品化精浆生化质控品相比，其明显优势就是不受运输条件影响，能有效避免运送过程中的不确定因素对质控品造成的影响。本研究对收集到的标本进行了56 ℃水浴加热的处理，有效灭活了精浆中的病毒成分，确保了自制精浆生化质控品不含传染性病毒[16-17]。

另外，在制作过程中用漩涡振荡器充分混匀以尽量缩小瓶间差异，并以小剂量分装保存，单次测定完可随即丢弃，避免了由多次使用过程带来的反复冻融造成质控品降解的情况。同时，自制精浆生化质控品均为人源精液，从而避免了额外的基质效应。但是，自制质控品并不能完全排除实际操作中的偶然误差而导致的瓶间差增加，因此，为了保证较小的瓶间差异，在制备质控品时应严格按照实验操作规程进行操作。

4 结 论

乙二醇组质控品精浆中性α-葡萄糖苷酶的检测水平存在瓶间差异，可能是人员操作不当引起的。丙二醇组在精浆生化各项目质控中稳定性最佳，三种质控品性能评价结果均符合临床要求，值得临床实验室推广使用。