室旁核输注褪黑素通过改善氧化应激对抗心肌缺血／再灌注损伤

杨金保，陈文生，刘大伟，金振晓，金屏，董小超

心肌缺血再灌注（myocardial ischemia reperfusion，MI／R）损伤是导致心脏患者死亡的重要原因［1］。 近年相关研究表明，褪黑素（melatonin，Mel）可以有效减轻 MI／R 损伤［2-3］；另有文献报道，神经体液的激发也参与了MI／R损伤的进展［4］。在高血压大鼠模型中发现，活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）在外周组织和室旁核组织中均有明显增加［5］，而室旁核（paraventricular nucleus，PVN）是一个调节交感神经活动和缺血性心脏病的关键中枢整合部位，这表明脑ROS参与诱导缺血性心脏病的神经体液激发。还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamideadenine dinucleotide phosphate， NADPH）和氮氧化物（nitrogen oxide，NOX）对于心血管系统中ROS的合成至关重要［6］。在大鼠缺血模型实验中证实ROS的过表达在MI／R损伤的进展中起重要作用［7］。

Mel是一种有显著抗氧化特性的激素［8］，它与ROS和NOX有交互作用，能够增加抗氧化酶活性并降低促氧化酶活性［9-10］。本实验室此前研究表明，Mel诱导的心脏保护作用是受体依赖性的，加之Mel兼具水溶性和脂溶性，易穿过血脑屏障进入中枢，且Mel受体也可在下丘脑中分布［11］。大量研究显示，交感神经兴奋可缩短心室不应期，引起外周血管和冠状动脉血管收缩，继而导致缺血性心脏病的发生［12］；Mel生物作用广泛，可抑制交感神经活动，恢复心脏β受体功能并改善压力感受性反射［13］，其抗肾上腺素能作用显著促进其抑制MI／R损伤中心肌细胞分子损伤的潜力［14］。然而，在PVN中的Mel对MI／R损伤的心肌保护作用尚未引起重视。因此，本课题旨在探究PVN中Mel对MI／R损伤的心脏保护作用。

1 材料与方法

1.1材料 成年雄性 Sprague Dawley（SD）健康大鼠220～285 g，由空军军医大学实验动物中心提供，并经空军军医大学动物保护委员会批准。微型渗透泵（Alzet Model 1004）购自美国 Durect公司；Mel（泵速 0.025 μg／h）购自美国 Sigma-Aldrich 公司；下丘脑PVN立体定位装置（WPI公司，美国）；图像分析软件（Media Cybernetics公司，美国）。超氧化物阴离子荧光探针二氢乙锭（Dihydroethidium，DHE，碧云天生物公司，中国上海）。

1.2方法

1.2.1实验分组及模型建立 将28只大鼠随机分为4组：①Sham＋PVN输注人工脑脊液（vehicle，V）；②Sham＋PVN 输注 Mel；③MI／R＋PVN 输注 V；④MI／R＋PVN输注 Mel。大鼠用3%戊巴比妥钠（30 mg／kg）腹腔注射麻醉，之后将其固定于立体定位装置上，参照室旁核定位图，在前囟后方1.8 mm，距正中线外侧0.4 mm处将不锈钢套管植入侧脑室PVN部位后连接到微型渗透泵，并将渗透泵植入颈后部皮下，用于缓慢输注 Mel（0.025 μg／h）或 V（0.025 μg／h）。1周后进行 MI／R的建立。所有大鼠麻醉后，开胸并结扎冠状动脉前降支模拟心肌缺血，缺血后30 min，将前降支结扎线松开使心肌再灌注6 h。在此模型建立后3周时分析心肌缺血和梗死面积的大小、蛋白表达情况和心脏功能。Sham组进行相同的手术操作，但穿过冠状动脉前降支的慕丝线不打结。模型建立后肌注青霉素预防感染。在实验结束时，所有大鼠用3%戊巴比妥钠麻醉后处死，用以收集外周血液和PVN脑组织用于后续的免疫组化研究。所有手术均在麻醉和无菌条件下进行。

1.2.2超声心动图评估 缺血再灌注3周后，所有大鼠行超声心动图检查，用以计算左心室功能，包括左室射血分数（left ventricular ejection fraction，LVEF），左室缩短率 （left ventricular shortening，LVFS）和左室舒张末期容积（left ventricular end-diastolic volume，LVEDV）。

1.2.3心肌梗死面积的测定 超声心动图检查之后，再次开胸并结扎冠状动脉前降支，并将2%伊文氏蓝（1 ml）染料由主动脉根部注入，很快染色剂便经由冠状动脉均匀分布于除了前降支灌注的其余心肌组织。立即摘除心脏并保存于-80℃液氮中约10 min，冷冻后取出并切成垂直于心脏长轴约1 mm厚的切片；将切片放置在1%氯化三苯四氮唑（TTC）的磷酸盐缓冲液（pH 7.4，温度 37℃）中孵育 20 min，再置于40 g／L的甲醛中固定过夜，次日用数码相机拍照。使用Image Pro-Plus软件分析伊文氏蓝染色区域（正常心肌），TTC染色区域（红色，缺血心肌）和灰白色区域（梗死心肌）。心肌梗死面积用总梗死面积占总切片心肌面积的百分比（INF／AAR×100%）表示。

1.2.4外周血标本和PVN组织的收集 所有大鼠用戊巴比妥钠麻醉并断头处死。收集外周血液样品并立即储存在-80℃液氮中用以测量去甲肾上腺素（norepinephrine，NE）的水平。开颅取完整的脑组织，在室温下固定于4%多聚甲醛PBS液中约5 h，然后移入30%蔗糖PBS液备用，直至组织下沉后取出；然后固定脑组织，并切取视交叉与乳头体之间的部分，在冰冻切片机上进行连续冠状切片，厚度约10 μm，将切片贴于防脱玻片上，-80℃保存用于免疫组化。另取各组的大鼠PVN组织，称重后制成组织匀浆，并离心收集上清液，分装用于 ELISA和Western blot检测。

1.2.5免疫组化的测定 免疫组化用于检测PVN区脑组织的氧化应激水平。NOX2的一抗购自美国Santa公司。免疫组化中DAB（二氨基联苯胺）显色后细胞膜上出现棕黄色颗粒者为阳性细胞。在同一条件下对每张标本按顺序选取5个视野，计算每个视野经免疫组织化学染色阳性细胞占总细胞数的百分比，其中＜4%为阴性，＞6%为阳性。

1.2.6Western Blot分析 对 PVN 组织匀浆进行蛋白质印迹分析，以测定NOX2和铜锌超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，Cu／Zn-SOD）的蛋白表达水平。所用一抗均购自美国Santa公司。用NIH Image J软件分析条带密度。

1.2.7统计分析 所有实验数据均采用SPSS 13.0软件进行统计学分析，实验数据用均数±标准误（±s）表示，采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1PVN输注Mel可改善心功能及超声心动图指标 首先评估了PVN输注Mel对Sham组大鼠心脏的影响，结果显示：与Sham＋PVN输注V组对比，PVN输注 Mel对大鼠的心率（heart rate，HR）、LVEF、LVFS和 LVEDV 没有显著的影响（P＞0.05，表1）。 而与Sham＋PVN 输注 V 组比较，MI／R＋PVN输注V组却显示出明显的心肌损伤，其HR和LVEDV 增加、LVEF和 LVFS均降低（P＜0.05，表 1）。另外与 MI／R＋PVN 输注 V 组比较，MI／R＋PVN 输注Mel组显示LVEF和LVFS均显著增加，HR和LVEDV却有所降低（P＜0.05，表1）。 这些数据证明Mel治疗可改善MI／R引发的心肌损伤。

2.2PVN输注Mel显著降低心肌梗死面积 Sham＋PVN输注V组心脏的心肌梗死面积（2±0.6）%与Sham＋PVN 输注 Mel组（2±0.2）%比较无统计学差异（P＞0.05）。单纯手术组的心肌梗死面积与Sham＋PVN输注V组比较显著增加［MI／R＋PVN输注 V 组（38±4）%vs.Sham＋PVN 输注 V 组（2±0.6）%（P＜0.01）］。 而在 MI／R 组，给予 Mel后，大鼠心肌梗死面积明显减少［MI／R＋PVN 输注 Mel组（24±2）%vs.MI／R＋PVN 输注 V 组（38±4）%（P＜0.01）］。 见图1。

2.3PVN输注Mel可降低NE水平 NE是交感神经活动的标志物，通过ELISA盒子测量。与Sham＋PVN输注V组比较，在MI／R＋PVN输注V组大鼠的外周血浆和下丘脑PVN组织中，显示出更高水平的 NE 表达（P＜0.01）；然而，在 PVN 输注 Mel 1个月后，外周血浆和下丘脑PVN组织中NE的表达明显被抑制（P＜0.05）。 见图 2。

图1 各组间心肌梗死面积比较

图2 不同组间NE表达差异的比较

表1 超声心动图结果（±s）

表1 超声心动图结果（±s）

注：再灌注后3周进行超声心动图测量。＃P值为Sham＋PVN输注Mel组与Sham＋PVN输注V组比较；*P值为MI／R＋PVN输注V组与Sham＋PVN输注V组比较；△P值为MI／R＋PVN输注Mel组与MI／R＋PVN输注V组比较。

指标 Sham＋PVN输注V组Sham＋PVN输注Mel组 P值＃ MI／R＋PVN输注V组 P值* MI／R＋PVN输注Mel组 P值△HR（次／min） 329±19 326±8 0.595 399±11 0.016 364±10 0.021 LVEF（%） 81.6±6.5 80.3±8.1 0.511 51.6±5.6 0.033 63.2±5.8 0.041 LVFS（%） 51.3±8.0 52.2±6.4 0.682 30.3±4.6 0.024 38.7±5.5 0.031 LVEDV（ml） 0.55±0.1 0.58±0.06 0.657 1.21±0.17 0.011 0.88±0.13 0.016

2.4PVN输注Mel可改善Cu／Zn-SOD蛋白的表达

Western Blot用来测定作为抗氧化酶活性标志的Cu／Zn-SOD蛋白。Sham＋PVN输注V组心脏的Cu／Zn-SOD蛋白表达水平与Sham＋PVN输注Mel组比较无统计学差异（P＞0.05）。与Sham＋PVN输注V组相比，MI／R＋PVN输注V组大鼠在下丘脑PVN组织中Cu／Zn-SOD蛋白表达水平显著降低（P＜0.05）。在PVN输注Mel1个月后，MI／R＋PVN输注Mel组大鼠的大鼠的Cu／Zn-SOD蛋白表达较MI／R＋PVN输注V 组有显著升高（P＜0.05）。 见图3。

图3 PVN输注Mel对Cu／Zn-SOD蛋白表达的比较

图4 不同组间NOX2蛋白表达的比较

2.5PVN输注Mel可降低NOX2的表达水平 免疫组化和Western blot结果显示，Sham＋PVN输注V组与Sham＋PVN输注Mel组比较，NOX2阳性神经元数量和NOX2蛋白表达水平均无统计学差异（P＞0.05，图4 A～D）。 MI／R＋PVN 输注V 组大鼠的下丘脑PVN组织中NOX2阳性神经元数量较Sham＋PVN输注V组高（P＜0.001，图4 A和B），PVN输注Mel 1个月后，MI／R＋PVN输注Mel组大鼠的NOX2阳性神经元数量较MI／R＋PVN输注V组显著降低（P＜0.05，图 4 A 和 B）。 MI／R＋PVN 输注 V 组大鼠的下丘脑PVN组织中NOX2蛋白表达水平较Sham＋PVN输注V组显著升高（P＜0.05，图4 C和D），PVN输注Mel 1月后，MI／R＋PVN输注Mel组大鼠的NOX2蛋白表达水平较Sham＋PVN输注V组显著降低（P＜0.05，图 4 C 和 D）。

3 讨 论

在本研究中，笔者首次发现：①下丘脑PVN中过表达的氧化应激参与了MI／R损伤；②PVN输注Mel可提高抗氧化酶的活性，并抑制下丘脑PVN中NAD（P）H氧化酶亚基NOX2的表达水平；③PVN输注Mel显著降低了MI／R大鼠血浆和PVN中的NE水平。综述以上结果都表明下丘脑PVN输注Mel有助于改善MI／R损伤。

有文献报道，自主神经系统功能紊乱与过量的NE产生之间的相互作用对MI／R损伤至关重要。另有研究发现，心肌缺血后下丘脑PVN神经元活动的调节显著改变了外周交感神经的活动，并进一步改善了心肌缺血大鼠的心脏功能［14-15］。研究还表明，Mel可显著降低高血压大鼠的外周交感神经活动［16］。众所周知，Mel具有多种生物学效应，它可以透过血脑屏障，并且Mel受体在大脑组织中广泛表达，在下丘脑PVN组织中也很丰富［11］。鉴于Mel对外周交感神经活动的调节作用，本研究中也发现，与Sham＋PVN输注V组相比，MI／R＋PVN输注V组大鼠的PVN组织和血浆中NE的水平显著升高，而PVN输注Mel可降低NE的表达；这表明PVN输注Mel可减缓交感神经的过度激活，从而进一步改善MI／R损伤。Mel对交感神经过度激活的抑制作用可能与对氧化应激的调节有关。最近的研究表明，Mel的抗心肌缺血效应主要与抗氧化、抗自由基形成、降低心磷脂过氧化和减少线粒体释放等有关［17-18］。Mel可有效地与各种ROS相互作用，能够增加抗氧化酶并减少促氧化酶的产生［19］。下丘脑PVN中的NAD（P）H亚基，尤其是 NOX2和NOX4是ROS的主要来源。在下丘脑中，高水平的ROS是增强外周交感神经兴奋性的重要因素，阻断中枢ROS的形成可显著降低交感神经的活动［5］。SOD作为一种抗氧化酶，是抗ROS诱导的氧化组织损伤的第一道防线［20］。 本研究中发现，MI／R＋PVN 输注 V组PVN中NOX2的表达均显著升高，而抗氧化酶Cu／Zn-SOD的表达则较Sham＋PVN输注V组明显降低。然而，PVN输注Mel提高了Cu／Zn-SOD的表达水平，并降低了NOX2的表达。基于以上结果，笔者得出结论：下丘脑PVN中的Mel可通过激发抗氧化酶的过表达和抑制促氧化酶的表达来降低交感神经活动，并进一步改善MI／R损伤。

总之，本研究表明下丘脑PVN输注Mel可改善MI／R大鼠中SOD的降低和NOX2的增加；同时能够抑制MI／R大鼠NE的增加。这些结果表明PVN输注Mel可以通过减弱氧化应激和降低交感神经活动来对抗MI／R损伤。本研究表明Mel在PVN组织中具有潜在的抗氧化活性，为其在MI／R损伤中的治疗价值提供了证据；并进一步揭示了一种Mel在中枢神经系统治疗MI／R损伤的新方法。